পিটার সারনো দ্বারা সম্পাদিত, স্ট্যানফোর্ড ইউনিভার্সিটি স্কুল অফ মেডিসিন, স্ট্যানফোর্ড ইউনিভার্সিটি, ক্যালিফোর্নিয়া, 25 ডিসেম্বর, 2020-এ অনুমোদিত (25 অক্টোবর, 2020-এ পর্যালোচনা করা হয়েছে)
আমরা করোনাভাইরাস-ট্রান্সক্রিপশন কমপ্লেক্সের প্রতিলিপিতে সাবইউনিটের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া রিপোর্ট করি, যা প্রতিলিপি এবং বিবর্তনীয় সংরক্ষণের জন্য অপরিহার্য।আমরা প্রমাণ দিয়েছি যে এনএসপি 12 এর সাথে যুক্ত নিরান ডোমেনে ট্রান্সে নিউক্লিওসাইড মনোফসফেট (এনএমপি) ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপ রয়েছে এবং এনএসপি 9 (একটি আরএনএ বাইন্ডিং প্রোটিন) এর লক্ষ্য হিসাবে চিহ্নিত করেছি।NiRAN একটি বিক্রিয়ায় সংরক্ষিত nsp9 অ্যামিনো টার্মিনাসের সাথে NMP moiety-এর সমযোজী সংযুক্তিকে অনুঘটক করে যা Mn2+ আয়ন এবং সংলগ্ন সংরক্ষিত Asn অবশিষ্টাংশের উপর নির্ভর করে।এটি পাওয়া গেছে যে করোনাভাইরাস প্রতিলিপির জন্য NiRAN কার্যকলাপ এবং nsp9 NMPylation অপরিহার্য।ডেটা আমাদের এই অনুমানের পূর্ববর্তী পর্যবেক্ষণের সাথে নেস্টেড ভাইরাস এনজাইম মার্কারের এই কার্যকলাপকে লিঙ্ক করতে দেয় যে RNA ভাইরাসের একটি শ্রেণিতে RNA সংশ্লেষণের সূচনা কার্যকরী এবং বিবর্তনীয়ভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ।
নিডোভাইরালেসের আরএনএ-নির্ভর আরএনএ পলিমারেজ (আরডিআরপিএস) (করোনাভিরিডে, আর্টেরিওভিরিডে এবং অন্যান্য 12টি পরিবার) পলিপ্রোটিন থেকে নিঃসৃত নন-স্ট্রাকচারাল প্রোটিন (এনএসপি) অ্যামিনো-টার্মিনাল (এন-টার্মিনাল) ডোমেনের সাথে যুক্ত, যাকে NiRAN বলা হয়। 1ab ভাইরাল প্রধান প্রোটিজ (Mpro) দ্বারা গঠিত।পূর্বে, ধমনী ভাইরাস NiRAN-RdRp nsp-এর নিজস্ব GMPylation/UMPylation কার্যকলাপ রিপোর্ট করা হয়েছিল, এবং এটি (বর্তমানে অজানা) ভাইরাস এবং/অথবা কোষের বায়োপলিমারাইজেশন জিনিসগুলিতে নিউক্লিওসাইড মনোফসফেট (NMP) স্থানান্তরের জন্য একটি ক্ষণস্থায়ী উৎপন্ন করার পরামর্শ দেওয়া হয়েছিল।এখানে, আমরা দেখাই যে করোনাভাইরাস (হিউম্যান করোনাভাইরাস [HCoV]-229E এবং সিভিয়ার অ্যাকিউট রেসপিরেটরি সিনড্রোম করোনাভাইরাস 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) এর Mn2+-নির্ভর NMPylation কার্যকলাপ রয়েছে, যা Mpro-মধ্যস্থ nsp9 গঠনের মাধ্যমে nsp9 থেকে উদ্ভূত হয়েছে। এন-টার্মিনাল ফ্ল্যাঙ্কিং এনএসপিএস প্রোটিওলিটিকভাবে মুক্তি পায়, ফসফরামিডেট এনএসপি9-এর এন-টার্মিনালে প্রাথমিক অ্যামাইন (N3825) এর সাথে বন্ধন করা হয়।এই বিক্রিয়ায় ইউরিডিন ট্রাইফসফেট পছন্দের নিউক্লিওটাইড, তবে অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট, গুয়ানোসিন ট্রাইফসফেট এবং সাইটিডিন ট্রাইফসফেটও উপযুক্ত সহ-সাবস্ট্রেট।রিকম্বিন্যান্ট করোনাভাইরাস nsp9 এবং nsp12 প্রোটিন এবং জেনেটিকালি ইঞ্জিনিয়ারড HCoV-229E মিউট্যান্টগুলি ব্যবহার করে মিউটেশন স্টাডিগুলি NiRAN-মধ্যস্থ nsp9 NMPylation এবং কোষ সংস্কৃতিতে ভাইরাস প্রতিলিপির জন্য প্রয়োজনীয় অবশিষ্টাংশগুলি নির্ধারণ করেছে।ডেটা NiRAN সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশের পূর্বাভাস নিশ্চিত করেছে এবং nsp9 NMPylation এবং ভিট্রোতে ভাইরাস প্রতিলিপিতে nsp9 N3826 অবশিষ্টাংশের গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা নির্ধারণ করেছে।এই অবশিষ্টাংশটি সংরক্ষিত N-টার্মিনাল NNE ট্রিপেপটাইড সিকোয়েন্সের অংশ এবং এটি করোনাভাইরাস পরিবারে nsp9 এবং এর হোমোলগগুলির একমাত্র অপরিবর্তনীয় অবশিষ্টাংশ বলে প্রমাণিত হয়েছে।এই অধ্যয়নটি অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাসের NMPylation কার্যকলাপের কার্যকরী অধ্যয়নের জন্য একটি শক্ত ভিত্তি প্রদান করে এবং অ্যান্টিভাইরাল ওষুধের বিকাশের জন্য সম্ভাব্য লক্ষ্যগুলি প্রস্তাব করে।
নিডোভাইরালেস পজিটিভ-স্ট্র্যান্ডেড আরএনএ ভাইরাস বিভিন্ন মেরুদণ্ডী এবং অমেরুদণ্ডী প্রাণীকে সংক্রামিত করে (1, 2)।অর্ডারটিতে বর্তমানে 14টি পরিবার (3) অন্তর্ভুক্ত রয়েছে, যার মধ্যে গত 20 বছরে করোনাভাইরাস পরিবার ব্যাপকভাবে অধ্যয়ন করা হয়েছে।সেই সময়ে, তিনটি জুনোটিক করোনভাইরাস প্রাণীর হোস্ট থেকে উদ্ভূত হয়েছিল এবং মানুষের মধ্যে গুরুতর শ্বাসযন্ত্রের সংক্রমণের বড় আকারের প্রাদুর্ভাব ঘটায়।গুরুতর তীব্র সংক্রামক রোগের কারণে ক্রমাগত মহামারী সহ।রেসপিরেটরি সিনড্রোম করোনাভাইরাস 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)।নিডোভাইরাসগুলি একটি সাধারণ জিনোম সংস্থাকে ভাগ করে, এবং ঝিল্লি-বাউন্ড রেপ্লিকেশন-ট্রান্সক্রিপশন কমপ্লেক্সের (RTC) সাবইউনিটটি 5-?²-টার্মিনাল দুই-তৃতীয়াংশ এবং ভাইরাস কণার প্রধান কাঠামোগত সাবইউনিটে এনকোড করা হয়, সেইসাথে কিছু জিনিসপত্র .প্রোটিন, জিনোমের 3??² শেষ তৃতীয়াংশে এনকোড করা হয়েছে (1)।প্ল্যানারিয়ান ভাইরাসের একটি পরিবার (মনোভিরিডে) (8) বাদে, সমস্ত নেস্টেড ভাইরাস দুটি বড় ওপেন রিডিং ফ্রেমে (ORF) ORF1a এবং ORF1b-এ RTC সাবইউনিটগুলিকে এনকোড করে, যেগুলি এর জিনোমিক RNA থেকে অনুবাদ করা হয়।ORF1a পলিপ্রোটিন (pp) 1a এনকোড করে এবং ORF1a এবং ORF1b যৌথভাবে pp1ab এনকোড করে।ORF1a দ্বারা এনকোড করা প্রধান প্রোটিজ (Mpro) এর সাধারণ অংশগ্রহণের সাথে, pp1a এবং pp1ab উভয়ই প্রোটিওলিটিকভাবে বিভিন্ন ধরনের অ-কাঠামোগত প্রোটিনে (এনএসপিএস) প্রক্রিয়াজাত করা হয়, যা 3CLpro নামেও পরিচিত, কারণ এতে পিকোর্নাভাইরাস (3Cpro) এর সাথে সমতা রয়েছে। 9)।এই এনএসপিগুলিকে একটি বৃহৎ গতিশীল আরটিসিতে একত্রিত করা হয় বলে মনে করা হয়, জিনোমিক আরএনএ (প্রতিলিপি) এবং সাবজেনোমিক আরএনএ (ট্রান্সক্রিপশন) এর একটি সেটের সংশ্লেষণকে অনুঘটক করে এবং ORF1b (10%? ?12)।
মূল RTC-এর মধ্যে রয়েছে RNA-নির্ভর RNA পলিমারেজ (RdRp) (13), সুপারফ্যামিলি 1 হেলিকেস (HEL1) (14, 15) এবং বেশ কয়েকটি RNA প্রক্রিয়াকরণ এনজাইম, যা মূলত ORF1b-এ এনকোড করা আছে এবং করোনাভাইরাস পরিবারে এতে রয়েছে nsp12-nsp16 এবং Arterioviridae পরিবারে nsp9-nsp12 (রেফারেন্স 10ââ 12 দেখুন)।RdRp এবং HEL1 পাখির নীড়ের ভাইরাসের দুটি (এক-পঞ্চমাংশ) সংরক্ষিত ডোমেনের প্রতিনিধিত্ব করে এবং অন্যান্য আরএনএ ভাইরাসগুলির মধ্যে সমতা রয়েছে।কোর প্রতিলিপিকে অন্যান্য সাবইউনিট দ্বারা সহায়তা করা হয় বলে মনে করা হয়, যার মধ্যে রয়েছে pp1a এর কার্বক্সি-টার্মিনাল (সি-টার্মিনাল) অঞ্চল থেকে মুক্তি পাওয়া বেশ কয়েকটি ছোট এনএসপি, এমপ্রোর ডাউনস্ট্রিম (করোনাভাইরাস এনএসপি5 এবং ধমনী ভাইরাস এনএসপি4, যথাক্রমে)।তাদের সীমিত পরিবার-নির্দিষ্ট সুরক্ষা এবং বিভিন্ন কার্যক্রম রয়েছে (রেফারেন্স 10ââ12 এ পর্যালোচনা করা হয়েছে)।
তুলনামূলকভাবে সম্প্রতি, সমস্ত নেস্টেড ভাইরাসে RdRp-এর সংলগ্ন অ্যামিনো টার্মিনাস (N-টার্মিনাস) এ অনন্য সিকোয়েন্স মোটিফ বৈশিষ্ট্য সহ একটি ডোমেন পাওয়া গেছে, কিন্তু অন্য কোন আরএনএ ভাইরাস (16) নেই।এর অবস্থান এবং নিউক্লিওটাইড ট্রান্সফারেজ (নিউক্লিওসাইড মনোফসফেট [NMP] ট্রান্সফারেজ) কার্যকলাপের উপর ভিত্তি করে, এই ডোমেনের নাম NiRAN (Nestvirus RdRp-সম্পর্কিত নিউক্লিওটাইড ট্রান্সফারেজ)।NiRAN-RdRp-এর দ্বৈত-ডোমেন সংমিশ্রণ করোনাভাইরিডে পরিবারে nsp12 এবং Arterioviridae পরিবারে nsp9 গঠন করে এবং অন্যান্য নেস্টোভিরিডে, NiRAN-RdRp ভাইরাল পলিপ্রোটিন থেকে একটি স্বাধীন এনএসপি হিসাবে মুক্তি পাবে বলে আশা করা হচ্ছে।করোনাভাইরাসে, NiRAN ডোমেনে ?? 1/450 অবশিষ্টাংশ থাকে এবং লিঙ্কার অঞ্চলের মাধ্যমে C-টার্মিনাল RdRp ডোমেনের সাথে সংযুক্ত থাকে (16?19)।Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), রিকম্বিন্যান্ট nsp9 Mn2+ আয়ন-নির্ভর (স্ব) UMPylation এবং GMPylation কার্যক্রম দেখায়, যা নেস্টোভাইরাস, AN, BN এবং CN-এ তিনটি সংরক্ষিত ক্রম ভিত্তির উপর নির্ভর করে অনুক্রমের অবশিষ্টাংশ।যেখানে N মানে NiRAN) (16)।এই মোটিফগুলির N-টার্মিনাল ফ্ল্যাঙ্কিং একটি কম রক্ষণশীল মোটিফ preAN।এই অবশিষ্টাংশগুলির মধ্যে কিছু দূরবর্তী প্রোটিন কাইনেসেও সংরক্ষণ করা হয়, যেখানে তারা নিউক্লিওসাইড ট্রাইফসফেট (এনটিপি) বাইন্ডিং এবং অনুঘটক কার্যকলাপ (20, 21) এর সাথে জড়িত দেখানো হয়েছে।এই পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, Pseudomonas syringae থেকে pseudokinase SelO-তে থাকা বেশ কয়েকটি মূল সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশ সম্প্রতি প্রকাশিত SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 সুপার কমপ্লেক্সের সাথে একত্রিত করা যেতে পারে।সংরক্ষিত করোনভাইরাস নিরান অবশিষ্টাংশগুলি ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্ট্রাকচারে সুপারইম্পোজ করা হয়েছে।রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন (17)।এটা অনুমান করা হয় যে নথিভুক্ত (স্ব) U/GMPylation NMP (বর্তমানে অজানা) সাবস্ট্রেটে (16) স্থানান্তর করার জন্য একটি ক্ষণস্থায়ী অবস্থা তৈরি করবে, এবং NiRAN এবং প্রোটিন কাইনেস (17, 19) এর মধ্যে কাঠামোগত সাদৃশ্য হল অনুমান যে NiRAN অন্যান্য প্রোটিন পরিবর্তন করে।
নেস্টেড ভাইরাসের সাথে এর অনন্য এবং অনন্য পদ্ধতিগত সম্পর্ক এবং RdRp থেকে জেনেটিক বিচ্ছেদ সহ অনেক বৈশিষ্ট্য NiRAN কে নেস্টেড ভাইরাসগুলির জন্য একটি যুক্তিসঙ্গত মূল নিয়ন্ত্রক এনজাইম করে তোলে, যা তাদের উদ্ভব এবং পরিচয়ের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।পূর্বে, জিনোম/সাবজেনোমিক ট্রান্সলেশন বা প্রতিলিপি/ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণের জন্য NiRAN-এর সাথে জড়িত তিনটি সম্ভাব্য ফাংশন বলা হত।সেই সময়ে উপলব্ধ দুষ্প্রাপ্য এবং অসম্পূর্ণ ডেটা বিবেচনা করার সময়, প্রতিটি ফাংশনের সুবিধা এবং অসুবিধা রয়েছে (16)।এই গবেষণায়, আমরা দুটি জেনারের প্রতিনিধিত্বকারী করোনভাইরাসগুলির জৈব রাসায়নিক এবং বিপরীত জেনেটিক অধ্যয়নগুলিকে একত্রিত করার লক্ষ্য রাখি এবং আমাদের ফলাফলগুলিকে করোনভাইরাস পরিবারের প্রাকৃতিক মিউটেশনের বিবর্তনীয় পটভূমিতে রাখি, যাতে এই রহস্যময় রাজ্যের অন্তর্দৃষ্টি পেতে পারি।আমরা RTC-তে প্রাকৃতিক লক্ষ্যমাত্রা সনাক্তকরণের মাধ্যমে NiRAN-এর বোঝার ক্ষেত্রে বড় অগ্রগতির রিপোর্ট করি, যা (তিনটি উপলব্ধ অনুমানের মধ্যে) নেস্টেড ভাইরাস RNA সংশ্লেষণ শুরু করার ক্ষেত্রে এই ডোমেনের ভূমিকায় অবদান রাখে।এই গবেষণাটি ভাইরাস হোস্ট ইন্টারফেসে NiRAN-এর অন্যান্য ভূমিকার সম্ভাবনাও উন্মুক্ত করে।
করোনা ভাইরাস nsp12-সম্পর্কিত NiRAN ডোমেনের এনজাইমেটিক বৈশিষ্ট্যগুলিকে চিহ্নিত করার জন্য, আমরা E. coli-তে হিউম্যান করোনাভাইরাস 229E (HCoV-229E) nsp12-এর একটি রিকম্বিন্যান্ট ফর্ম তৈরি করেছি, C-টার্মিনাসে His6 ট্যাগ সহ, এবং একত্রিত করেছি। [α32-P] সহ প্রোটিন MnCl2 এর উপস্থিতিতে NTP-এর সাথে একত্রে ইনকিউবেট করে যেমন উপাদান এবং পদ্ধতিতে বর্ণনা করা হয়েছে।প্রতিক্রিয়া পণ্যের বিশ্লেষণ এনএসপি 12 (106 কেডিএ) এর সাথে একটি রেডিওলেবেলযুক্ত প্রোটিনের সহ-স্থানান্তরের উপস্থিতি নির্দেশ করে, ইঙ্গিত করে যে করোনাভাইরাস এনএসপি 12 সমযোজী প্রোটিন-এনএমপি অ্যাডাক্টের গঠনকে অনুঘটক করে, যা ইউরিডিন মনোফসফেট (ইউএমপি) (চিত্র 1) দিয়ে গঠিত। খ)।পরিমাণগত বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অন্যান্য নিউক্লিওটাইডের তুলনায়, UMP সংযোজনের সংকেতের তীব্রতা 2 থেকে 3 গুণ বেড়েছে (চিত্র 1C)।এই ডেটা করোনভাইরাস (16) এর NiRAN ডোমেনের পূর্বাভাসিত NMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, তবে নির্দেশ করে যে করোনভাইরাস এবং ধমনী ভাইরাসের NiRAN ডোমেনের নিউক্লিওটাইড পছন্দগুলি আলাদা।
HCoV-229E nsp12 এর স্ব-NMPylation কার্যকলাপ।(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 30 মিনিটের জন্য 6 mM MnCl2 এর উপস্থিতিতে মনোনীত [α-32P] NTP দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল (বিস্তারিত তথ্যের জন্য উপাদান এবং পদ্ধতি দেখুন)।প্রতিক্রিয়া পণ্যগুলি SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং Coomassie উজ্জ্বল নীল দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল।(বি) রেডিওলেবেলযুক্ত প্রোটিন ফসফরাস ইমেজিং দ্বারা কল্পনা করা হয়।nsp12-His6 এবং প্রোটিন আণবিক ভর চিহ্নিতকারীর অবস্থান (কিলোডাল্টনে) A এবং B তে দেখানো হয়েছে। (C) তেজস্ক্রিয় সংকেতের তীব্রতা (মানে ± SEM) তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে নির্ধারণ করা হয়েছিল।*P≤0.05।সংকেত শক্তি (শতাংশ) UTP এর সাথে সম্পর্কিত।
যদিও নিরান-সম্পর্কিত এনজাইম ক্রিয়াকলাপগুলি কোষ সংস্কৃতিতে EAV এবং SARS-CoV-এর প্রতিলিপির জন্য অপরিহার্য বলে দেখানো হয়েছে (16), নির্দিষ্ট NiRAN ফাংশন এবং সম্ভাব্য লক্ষ্যগুলি এখনও নির্ধারণ করা হয়নি।NiRAN এবং প্রোটিন কাইনেজ-এর মতো ভাঁজ (17, 22) প্রোটিনের পরিবারের মধ্যে সম্প্রতি রিপোর্ট করা কাঠামোগত মিল আমাদের অনুমান পরীক্ষা করতে প্ররোচিত করেছে যে NiRAN অন্যান্য প্রোটিনের NMPylation অনুঘটক করে।আমরা HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) দ্বারা এনকোড করা অ-কাঠামোগত প্রোটিন সহ সম্ভাব্য সমজাতীয় লক্ষ্যগুলির একটি সেট তৈরি করেছি, প্রতিটিতে একটি C-টার্মিনাল His6 ট্যাগ রয়েছে (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1), এবং nsp12-এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে [α32-P] ইউরিডিন ট্রাইফসফেট ([α32-P]UTP) দিয়ে এই প্রোটিনগুলিকে ইনকিউবেট করুন।বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন এবং ই. কোলাইতে উৎপন্ন MBP-LacZα ফিউশন প্রোটিন নিয়ন্ত্রণ হিসেবে কাজ করে (চিত্র 2A, লেন 1 থেকে 7)।রেডিওলেবেলযুক্ত প্রোটিনটি সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট-পলিয়াক্রাইলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (এসডিএস-পেজ) এবং অটোরেডিওগ্রাফি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং এটি পাওয়া গেছে যে এনএসপি 12 এবং এনএসপি 9 ধারণকারী প্রতিক্রিয়াতে একটি শক্তিশালী তেজস্ক্রিয় সংকেত ছিল।সংকেতের অবস্থান nsp9 এর আণবিক ভরের সাথে মিলে যায়, যা nsp9-এর nsp12-মধ্যস্থ UMPylation নির্দেশ করে (চিত্র 2B, ট্র্যাক 7)।অন্য কোনো পরীক্ষার প্রোটিন UMPylated পাওয়া যায়নি, যা আমাদের এই সিদ্ধান্তে পৌঁছেছে যে nsp9 হল nsp12-এর একটি নির্দিষ্ট স্তর।চিত্র 1-এ দেখানো স্ব-NMPylation ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, nsp12 চারটি NMP-কে nsp9-তে স্থানান্তর করতে সক্ষম, যদিও কার্যকারিতা ভিন্ন, UMP> অ্যাডেনোসিন মনোফসফেট (AMP)> গুয়ানোসিন মনোফসফেট (GMP)> সাইটিডাইন মনোফসফেট (CMP) ছবি)।3 A এবং B)।এই পরীক্ষায় ব্যবহৃত অবস্থার অধীনে (প্রতিক্রিয়া এবং এক্সপোজারের সময় সংক্ষিপ্ত করুন, nsp12 এর ঘনত্ব হ্রাস করুন; উপকরণ এবং পদ্ধতি), nsp12 এর স্ব-NMPylation সনাক্ত করা যায়নি (চিত্র 2B, লেন 7, এবং চিত্র 1B তুলনা করুন), যা একটি কার্যকরী (এবং একাধিক রাউন্ড) প্রমাণ করেছে UMP nsp12 থেকে nsp9-এ সরানো হয়েছে।UMP ট্রান্সফারেজ ক্রিয়াকলাপের জন্য Mn2+ আয়নের উপস্থিতি প্রয়োজন, যেমন চিত্র 3C-তে দেখানো হয়েছে, যখন Mg2+-এর উপস্থিতিতে কেবলমাত্র ন্যূনতম UMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপ পরিলক্ষিত হয়েছে, এবং পরীক্ষিত অন্য দুটি ডিভালেন্ট ক্যাশনের উপস্থিতিতে কোনো কার্যকলাপ নেই।সাইটিডাইন ট্রাইফসফেট (সিটিপি), গুয়ানোসিন ট্রাইফসফেট (জিটিপি), এবং অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট (এটিপি) (এসআই অ্যাপেন্ডিক্স, চিত্র এস 1) ধারণকারী এনএমপিলেশন অ্যাসেসগুলিতে অনুরূপ ডেটা প্রাপ্ত হয়েছিল।
nsp9-এর HCoV-229E nsp12-মধ্যস্থ UMPylation.প্রোটিন সাবস্ট্রেটের একটি সিরিজ (বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন, MBP-lacZα, এবং ORF1a দ্বারা এনকোড করা C-টার্মিনাল His6 সহ লেবেলযুক্ত HCoV-229E nsps-এর একটি সিরিজ) HCoV-229E nsp12-Histed⁺ এর UMPylation কার্যকলাপ মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রোটিনউপকরণ এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত nsp12-এর অনুপস্থিতি (A) বা উপস্থিতি (B) এর মধ্যে 10 মিনিটের জন্য [α-32P] UTP দিয়ে প্রোটিন ক্ষরণ করুন।A এবং B এর শীর্ষে, কুমাসি ব্রিলিয়ান্ট ব্লু দিয়ে দাগযুক্ত SDS-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল দেখানো হয়েছে এবং A এবং B এর নীচে, সংশ্লিষ্ট অটোরেডিওগ্রামগুলি দেখানো হয়েছে।প্রোটিন আণবিক ভর চিহ্নিতকারীর অবস্থান (কিলোডাল্টনে) বাম দিকে দেওয়া আছে।nsp12-His6 (B, top) এর অবস্থান এবং nsp9-His6 (B, লেন 7) এর সাথে nsp12-His6 এর ইনকিউবেশনের সময় পর্যবেক্ষণ করা তেজস্ক্রিয় সংকেতও নির্দেশিত হয়, যা নির্দেশ করে যে [α-32P] UMP থেকে nsp9-His6 ( 12.9 kDa), যা পরীক্ষিত অন্যান্য প্রোটিনের জন্য পরিলক্ষিত হয়নি।
এনএসপি9 এনএমপিলেশনের HCoV-229E নিরান-মধ্যস্থিত জৈব রাসায়নিক এবং ভাইরোলজিকাল বৈশিষ্ট্য।(A এবং B) বিক্রিয়ায় ব্যবহৃত নিউক্লিওটাইড কো-সাবস্ট্রেটের ভূমিকা।Nsp12-His6 এবং nsp9-His6 বিভিন্ন [α-32P] NTP-এর উপস্থিতিতে প্রমিত NMPylation অ্যাসে মিশ্রিত এবং ইনকিউবেট করা হয়।(A, শীর্ষ) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছে।(এ, নীচে) জেলের একই এলাকার অটোরেডিওগ্রাফ।(বি) মনোনীত নিউক্লিওটাইড কোফ্যাক্টরের উপস্থিতিতে আপেক্ষিক কার্যকলাপ (মান ± SEM) তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে নির্ধারিত হয়।*P≤0.05।(C) ধাতব আয়নগুলির ভূমিকা।[α-32P] UTP এবং বিভিন্ন ধাতব আয়নের উপস্থিতিতে স্ট্যান্ডার্ড NMPylation পরীক্ষা দেখানো হয়েছে, প্রতিটির ঘনত্ব 1 মিমি।C-তে, উপরে, Coomassie stained nsp9-His6 দেখানো হয়েছে, এবং C-তে, নীচে, সংশ্লিষ্ট অটোরেডিওগ্রাফি দেখানো হয়েছে।লেবেলযুক্ত প্রোটিনের আকার (কিলোডাল্টনে) A এবং C-এর বামদিকে দেখানো হয়েছে। (D) HCoV-229E nsp12-His6-এর মিউট্যান্ট ফর্ম নির্দিষ্ট অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপন বহন করে [α-32P]UTP-তে, যেমন বর্ণনা করা হয়েছে উপকরণ এবং পদ্ধতিতে।এনএমপিলেশন প্রতিক্রিয়ায় উত্পাদিত রেডিওলেবেলযুক্ত nsp9-His6 ফসফোরিলেশন ইমেজিং (ডি, টপ) দ্বারা সনাক্ত করা হয়।ওয়াইল্ড-টাইপ (ডব্লিউটি) প্রোটিনের সাথে তুলনামূলক আপেক্ষিক কার্যকলাপ ডি তে দেখানো হয়েছে, এবং নীচে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে গড় (±SEM) হিসাবে নেওয়া হয়েছে।তারকাচিহ্নগুলি অ-সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশের প্রতিস্থাপন নির্দেশ করে।(ই) প্লাক অ্যাস দ্বারা সংক্রমণের 24 ঘন্টা পরে প্রাপ্ত p1 কোষের কালচার সুপারনেট্যান্টের ভাইরাস টাইটার।ইঞ্জিনিয়ারড HCoV-229E মিউট্যান্টের NiRAN ডোমেনে কোডন প্রতিস্থাপন নির্দেশিত হয় (অবশিষ্ট সংখ্যা pp1ab-তে তাদের অবস্থানের উপর ভিত্তি করে)।প্রতিলিপি-ঘাটতি RdRp সক্রিয় সাইট মিউট্যান্ট nsp12_DD4823/4AA একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
NiRAN-এর সক্রিয় সাইট সম্পর্কে গভীরভাবে বোঝার জন্য এবং nsp9-নির্দিষ্ট NMP ট্রান্সফারেজের কার্যকলাপের সাথে সম্পর্কিত অবশিষ্টাংশগুলি নির্ধারণ করার জন্য, আমরা মিউটেশন বিশ্লেষণ করেছি, যেখানে আমরা NiRAN AN, BN এবং CN মোটিফগুলিতে রক্ষণশীল অবশিষ্টাংশগুলি প্রতিস্থাপন করেছি ( 16) এটি আলা (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S2)।উপরন্তু, রক্ষণশীল Arg-to-Lys বা Lys-to-Arg প্রতিস্থাপনের প্রভাব দুটি ক্ষেত্রে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।একটি (নেতিবাচক) নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, করোনাভাইরাস এবং অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাসগুলির নিরান ডোমেনে বা কম সংরক্ষিত নয় এমন অবশিষ্টাংশগুলিকে আলা দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়। K4116A (মোটিফ প্রিএএন-এ), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (মোটিফ) প্রতিস্থাপন করা হয়। BN) এবং D4280A (CN) উল্লেখযোগ্যভাবে nsp12 এর মাধ্যমে nsp9 NMPylation হ্রাস বা নির্মূল করে, যখন রক্ষণশীল প্রতিস্থাপন (R4178K), K4116R) সহ প্রোটিনগুলি তাদের কার্যকলাপের 60% এবং 80% ধরে রাখে, যা নির্দেশ করে যে তাদের নিজ নিজ দিকে বিধিনিষেধের শিথিলকরণ চেইনগুলি শারীরিক রাসায়নিকভাবে সংবেদনশীল (চিত্র 3D)।অন্যান্য সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশ E4145A, D4273A, F4281A এবং D4283A প্রতিস্থাপন করা অনেক কম ক্ষতিকর, এবং nsp9 UMPylation শুধুমাত্র মাঝারিভাবে হ্রাস করা হয়।অন্যান্য এনটিপি (চিত্র 3D এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3) জড়িত nsp9 NMPylation প্রতিক্রিয়াগুলিতে অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে, এটি নিশ্চিত করে যে নির্দিষ্ট অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপনের উপর পর্যবেক্ষণ করা প্রভাবগুলি ব্যবহৃত নিউক্লিওটাইড কো-সাবস্ট্রেটের ধরণের থেকে স্বাধীন।এর পরে, আমরা কোষ সংস্কৃতিতে করোনভাইরাসগুলির প্রতিলিপিতে এই এনএসপি 12 বিকল্পগুলির সম্ভাব্য প্রভাব পরীক্ষা করেছি।এই লক্ষ্যে, আমরা 5 -7 কোষ প্রতিলিপি করার জন্য রিকম্বিন্যান্ট ভ্যাক্সিনিয়া ভাইরাস (23, 24) এ ক্লোন করা উপযুক্ত জেনেটিকালি ইঞ্জিনিয়ারড কমপ্লিমেন্টারি ডিএনএ (cDNA) টেমপ্লেট ব্যবহার করেছি।এই কোষগুলিতে উত্পাদিত সংক্রামক ভাইরাস বংশের টাইট্রেশন দেখায় যে বেশিরভাগ HCoV-229E নিরান মিউট্যান্টগুলি সম্ভব নয় (চিত্র 3E)।অ-যোগ্য ভাইরাল মিউট্যান্টদের একটি গোষ্ঠীর মধ্যে বিকল্প রয়েছে যা ভিট্রোতে NMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপকে বাদ দিতে বা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে দেখানো হয়েছে (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), তবে আরও দুটি বিকল্প রয়েছে (K4116R, E414A) % সংরক্ষিত?তাদের ইন ভিট্রো এনএমপিলেশন কার্যকলাপ পরামর্শ দেয় যে অতিরিক্ত বিধিনিষেধ জড়িত।একইভাবে, অন্য দুটি মিউটেশন (R4178K, F4281A) যা NiRAN-এর ইন ভিট্রো এনএমপিলেশন কার্যকলাপে একটি মাঝারি হ্রাস ঘটায়, লাইভ ভাইরাস তৈরি করে, তবে, এই ভাইরাসগুলি প্রতিলিপির মাধ্যমে টাইটারগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে।চিত্র 3D-তে দেখানো ইন-ভিট্রো অ্যাক্টিভিটি ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, চারটি অন্যান্য অবশিষ্টাংশ প্রতিস্থাপন করে যা করোনাভাইরাস এবং/অথবা অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাসে (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) কার্যকরী ভাইরাস তৈরি করে, সন্তানসন্ততি থাকা সত্ত্বেও ওয়াইল্ড-টাইপ ভাইরাসের তুলনায় একটি মাঝারিভাবে হ্রাসকৃত টাইটার (চিত্র 3E)।
NiRAN-মধ্যস্থিত NMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপ সক্রিয় RdRp ডোমেনের উপর নির্ভর করে কিনা তা অধ্যয়ন করার জন্য, RdRp মোটিফ সি-তে ডাইভালেন্ট মেটাল আয়ন (11) এর সমন্বয়ের সাথে জড়িত দুটি সংরক্ষিত Asp অবশিষ্টাংশ আলা দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। ফলে প্রোটিন nsp12_DD4823/4AA বজায় থাকে এর nsp9 NMPylation কার্যকলাপ, ইঙ্গিত করে যে nsp12- মধ্যস্থতা ইন ভিট্রো nsp9 NMPylation কার্যকলাপের জন্য পলিমারেজ কার্যকলাপের প্রয়োজন হয় না (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S4)।
nsp12-এর জন্য nsp9-নির্দিষ্ট NMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপ প্রতিষ্ঠা করার পরে, আমরা ভর স্পেকট্রোমেট্রি (MS) দ্বারা NMP-nsp9 অ্যাডাক্টকে চিহ্নিত করার চেষ্টা করেছি।রিকম্বিন্যান্ট HCoV-229E nsp9-এর সম্পূর্ণ প্রোটিন ভর স্পেকট্রাম 12,045 Da (চিত্র 4A) তে সর্বোচ্চ দেখায়।nsp12 এর সংযোজন nsp9-এর গুণমান পরিবর্তন করেনি, ইঙ্গিত করে যে nsp12 এবং nsp9 ব্যবহৃত অবস্থার অধীনে একটি স্থিতিশীল কমপ্লেক্স গঠন করবে না (ডিনাচুরেশন) (চিত্র 4A)।UTP এবং GTP-এর উপস্থিতিতে, যথাক্রমে nsp9 এবং nsp12 সমন্বিত প্রতিক্রিয়ার ভর পরিমাপ দেখায় যে UTP-এর প্রোটিন ভর 306 Da সরানো হয়েছে, এবং GTP-এর প্রোটিন ভর 345 Da সরানো হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে প্রতিটি nsp9 অণু একটি UMP বা GMP কে আবদ্ধ করে। (ছবি 4) সি এবং ডি)।এটা অনুমান করা হয় যে NiRAN-মধ্যস্থ nsp9 NMPylation-এর জন্য প্রয়োজনীয় শক্তি NTP হাইড্রোলাইসিস এবং পাইরোফসফেট রিলিজ থেকে আসে।যদিও এই প্রতিক্রিয়ায় nsp12 (এনজাইম) এর তুলনায় nsp9 (টার্গেট) এর 10-গুণ বেশি মোলার ব্যবহার করা হয়েছিল, nsp9-এর প্রায় সম্পূর্ণ NMPylation পরিলক্ষিত হয়েছিল, যা ইঙ্গিত করে যে nsp12 এবং nsp9-এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া স্বল্পস্থায়ী, এবং nsp12 আরও nsp9 NMPylate করতে পারে। ভিট্রো অণুতে।
nsp12 এবং UTP বা GTP-এর উপস্থিতিতে nsp9-এর একক NMPylation।HCoV-229E nsp9 (SI অ্যাপেন্ডিক্স, টেবিল S1) (AD) এর ডিকনভোলুটেড সম্পূর্ণ প্রোটিন ভর স্পেকট্রাম দেখানো হয়েছে।(A) nsp9 একা, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP-এর উপস্থিতিতে, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP-এর উপস্থিতিতে।
nsp12 দ্বারা UMPylated nsp9 অবশিষ্টাংশ নির্ধারণ করতে, nsp9-UMP ট্রিপসিন দিয়ে ক্লিভ করা হয়েছিল।ফলস্বরূপ পেপটাইডগুলি ন্যানো-হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং অনলাইনে ট্যান্ডেম মাস স্পেকট্রোমেট্রি (MS/MS) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।বায়োনিক সফ্টওয়্যার প্যাকেজ (প্রোটিন মেট্রিক্স) ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ এন-টার্মিনাল অ্যামিনো অ্যাসিডের UMPylation দেখিয়েছে।এটি ম্যানুয়ালি নিশ্চিত করা হয়।পূর্ববর্তী পেপটাইডের টেন্ডেম ভর বর্ণালী [UMP]NNEIMPGK (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S5A) 421 m/z এ একটি খণ্ড প্রকাশ করে, যা নির্দেশ করে যে UMP nsp9 এর অবশিষ্টাংশ 1 এর সাথে আবদ্ধ।
nsp9-এর N-টার্মিনাসে, Asn অর্থোকরোনাভিরিনাই (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S6) এর সদস্যদের মধ্যে সংরক্ষিত হয়।যদিও আমরা বিশ্বাস করি যে এন-টার্মিনাল প্রাইমারি অ্যামাইন নাইট্রোজেন UMP-এর জন্য সম্ভবত গ্রহণকারী, আমরা N-টার্মিনালে NMP বাঁধার অতিরিক্ত প্রমাণ পাওয়ার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।এই কারণে, HPLC দ্বারা বিশুদ্ধ নন-NMPylated এবং NMPylated N-টার্মিনাল পেপটাইড nsp9 অ্যাসিটোন এবং সোডিয়াম সায়ানোবোরোহাইড্রাইডের উপস্থিতিতে উদ্ভূত হয়েছিল।এই অবস্থার অধীনে, শুধুমাত্র বিনামূল্যে প্রাথমিক অ্যামাইন propyl (25) দিয়ে সংশোধন করা যেতে পারে।N-টার্মিনাল nsp9-এর ক্রম NNEIMPGK সহ প্রাপ্ত পেপটাইডে দুটি প্রাথমিক অ্যামাইন রয়েছে, একটি Asn-এর N-টার্মিনাসে এবং অন্যটি C-টার্মিনাসে Lys-এর পাশের চেইনে।অতএব, উভয় প্রান্তে প্রপিল গ্রুপ চালু করা যেতে পারে।নন-এনএমপিলেটেড পেপটাইডের নিষ্কাশিত আয়ন ক্রোমাটোগ্রামগুলি এসআই পরিশিষ্ট, চিত্র S5B-তে দেখানো হয়েছে।প্রত্যাশিত হিসাবে, এন-টার্মিনাল এবং সি-টার্মিনাল (মনো)প্রোপাইলটেড (এসআই অ্যাপেন্ডিক্স, চিত্র S5B, উপরের গলি) এবং ডিপ্রোপাইলেড পেপটাইডস (এসআই অ্যাপেন্ডিক্স, চিত্র S5B, নিম্ন লেন) সনাক্ত করা যেতে পারে।nsp9 এর NMPylated N-টার্মিনাল পেপটাইড ব্যবহারের সাথে এই প্যাটার্নটি পরিবর্তিত হয়।এই ক্ষেত্রে, শুধুমাত্র সি-টার্মিনাল প্রোপিলেটেড পেপটাইডগুলি সনাক্ত করা যেতে পারে, তবে এন-টার্মিনাল প্রোপিলেটেড পেপটাইড এবং ডিপ্রোপাইলেটেড পেপটাইডগুলি সনাক্ত করা যায় না (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S5C), ইঙ্গিত করে যে UMP এন-টার্মিনাল প্রাইমারি অ্যামাইনে স্থানান্তরিত হয়েছে এটি প্রতিরোধ করার জন্য। পরিবর্তন করা থেকে গ্রুপ.
এর পরে, লক্ষ্য-নির্দিষ্ট সীমাবদ্ধতাগুলিকে সংজ্ঞায়িত করার জন্য আমরা nsp9-এর N-টার্মিনাসে সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশগুলিকে প্রতিস্থাপন করি (আলা বা Ser দিয়ে) বা মুছে ফেলি।আমাদের MS ডেটার উপর ভিত্তি করে যা দেখায় যে NiRAN nsp9-এর N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের প্রাথমিক অ্যামাইন দিয়ে একটি nsp9-NMP অ্যাডাক্ট গঠন করে, আমরা অনুমান করেছি যে nsp9 NMPylation থেকে nsp9 N-টার্মিনাল ছেড়ে দেওয়ার জন্য ভাইরাল মাস্টার প্রোটেজ (Mpro, nsp5) প্রয়োজন। এর পলিপ্রোটিন অগ্রদূত।এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা E. coli-তে nsp9 সম্বলিত একটি অগ্রদূত প্রোটিন nsp7-11 তৈরি করেছি এবং [α-32P] UTP (উপাদান এবং পদ্ধতি) এর উপস্থিতিতে একটি আদর্শ NMPylation পরীক্ষা করেছি।চিত্র 5A (লেন 3) তে দেখানো হয়েছে, nsp7-11 পূর্বসূরিটি nsp12 দিয়ে রেডিওলেবেলযুক্ত নয়।বিপরীতে, যদি nsp7-11 কে রিকম্বিন্যান্ট nsp5 দ্বারা ক্লিভ করা হয় যাতে পূর্বসূর থেকে nsp9 (এবং অন্যান্য nsps) মুক্ত হয়, একটি রেডিওলেবেলযুক্ত প্রোটিন সনাক্ত করা হয় যা nsp9 এর সাথে স্থানান্তরিত হয়, যা আমাদের উপসংহার নিশ্চিত করে যে NiRAN এবং N- সমযোজী nsp9-NMP বিজ্ঞাপনের নির্বাচনী গঠন। .N-টার্মিনাল Asn-এর টার্মিনাল প্রাথমিক অ্যামাইন (পজিশন 3825 pp1a/pp1ab-এ)।এই উপসংহারটি nsp9 কনস্ট্রাক্ট ব্যবহার করে পরীক্ষা দ্বারাও সমর্থিত, যা N-টার্মিনাসে এক বা দুটি অতিরিক্ত অবশিষ্টাংশ ধারণ করে।উভয় ক্ষেত্রেই, এনএসপি9-এর নিরান-মধ্যস্থ UMPylation বিলুপ্ত করা হয়েছিল (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S7)।এরপরে, আমরা nsp9-এর N-টার্মিনালে 3825-NNEIMPK-3832 পেপটাইড সিকোয়েন্স থেকে মুছে ফেলা এক বা দুটি Asn অবশিষ্টাংশ সহ একটি প্রোটিন তৈরি করেছি।উভয় ক্ষেত্রেই, nsp9 UMPylation সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ ছিল (চিত্র 5B), অতিরিক্ত প্রমাণ প্রদান করে যে প্রকৃত nsp9 N-টার্মিনাস একটি NMP রিসেপ্টর হিসাবে কাজ করে।
nsp9-এর প্রোটিওলাইটিক প্রক্রিয়াকরণ এবং nsp12-মধ্যস্থ UMPylation-এ N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের ভূমিকা।(A) nsp9 UMPylation একটি বিনামূল্যে nsp9 N-টার্মিনাল প্রয়োজন।Nsp7-11-His6 রিকম্বিন্যান্ট Mpro (nsp5-His6) এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে UTP ধারণকারী NMPylation সনাক্তকরণ বাফারে 30 °C তাপমাত্রায় প্রাক-ইনকিউবেটেড।3 ঘন্টা পরে, উপাদান এবং পদ্ধতিতে বর্ণিত nsp12-His6 যোগ করে NMPylation অ্যাস শুরু করুন।nsp5-His6 (লেন 1) এবং nsp9-His6 (লেন 2) ধারণকারী প্রতিক্রিয়া একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।10 মিনিটের পরে, প্রতিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়েছিল এবং প্রতিক্রিয়া মিশ্রণটি SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল।প্রোটিনটি কুমাসি ব্রিলিয়ান্ট ব্লু (এ, শীর্ষ) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল।Nsp7-11-His6 পূর্বসূর এবং nsp5-His6 মধ্যস্থতা ক্লিভেজের ফলে প্রক্রিয়াকৃত পণ্য ডানদিকে দেখানো হয়েছে।দয়া করে নোট করুন (তাদের ছোট আকারের কারণে) যে এই জেলে nsp7 এবং nsp11-His6 সনাক্ত করা যায় না, এবং প্রতিক্রিয়াটি nsp5-His6 (লেন 1 এবং 4; nsp5-His6 এর অবস্থান একটি কঠিন বৃত্ত দ্বারা নির্দেশিত) এর সাথে সম্পূরক হয়। বা nsp9-His6 (লেন 2) এ অবশিষ্ট অমেধ্য হিসাবে অল্প পরিমাণে MBP (খোলা চেনাশোনা দ্বারা নির্দেশিত) রয়েছে কারণ সেগুলি MBP ফিউশন প্রোটিন (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1) হিসাবে প্রকাশ করা হয়।(B) Nsp9-His6 ভেরিয়েন্টে এক বা দুটি N-টার্মিনাল Asn অবশিষ্টাংশ নেই (pp1a/pp1ab-এ অবস্থান অনুযায়ী অবশিষ্টাংশের সংখ্যা) এবং nsp12-His6 এবং [α-32P] UTP দিয়ে বিশুদ্ধ ও ধূসরিত।B, Coomassie-এর সাথে দাগযুক্ত SDS-PAGE উপরে দেখানো হয়েছে, B, সংশ্লিষ্ট অটোরেডিওগ্রাফ নীচে দেখানো হয়েছে।আণবিক ওজন চিহ্নিতকারীর অবস্থান (কিলোডাল্টনে) বাম দিকে দেখানো হয়েছে।(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-টার্মিনাল সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশগুলিকে Ala বা Ser দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল এবং nsp12-His6 মধ্যস্থতাকৃত UMPylation প্রতিক্রিয়াতে একই পরিমাণ প্রোটিন ব্যবহার করা হয়েছিল।প্রতিক্রিয়া পণ্যগুলি SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং Coomassie Brilliant Blue (C, top) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং রেডিওলেবেলযুক্ত nsp9-His6 ফসফোরেসেন্স ইমেজিং (সি, মধ্যম) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।একটি রেফারেন্স হিসাবে বন্য-টাইপ (wt) প্রোটিন ব্যবহার করে (100% সেট), আপেক্ষিক NMPylation কার্যকলাপ (মানে ± SEM) তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে গণনা করা হয়েছিল।(D) HCoV-229E বন্য-টাইপ Huh-7 কোষ দ্বারা সংক্রামিত Huh-7 কোষের p1 সেল কালচার সুপারনেট্যান্টের ভাইরাস টাইটার এবং nsp9-তে মনোনীত অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপন বহনকারী মিউট্যান্টগুলি প্লেক অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।প্রতিলিপি-ঘাটতি RdRp মোটিফ সি ডাবল মিউট্যান্ট DD4823/4AA নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
nsp9 এর N-টার্মিনাস (বিশেষ করে পজিশন 1, 2, 3, এবং 6) অর্থোকরোনাভিরিনা সাবফ্যামিলি (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S6) সদস্যদের মধ্যে খুব সংরক্ষিত।nsp12-মধ্যস্থ nsp9 NMPylation-এ এই অবশিষ্টাংশগুলির সম্ভাব্য ভূমিকা অধ্যয়ন করার জন্য, nsp9-এর N-টার্মিনাসে পরপর দুটি Asn অবশিষ্টাংশ আলা বা সের (একা বা সংমিশ্রণে) দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল।ওয়াইল্ড-টাইপ nsp9-এর সাথে তুলনা করে, আলা বা Ser দিয়ে N3825 প্রতিস্থাপনের ফলে nsp12-মধ্যস্থ UMPylation (চিত্র 5C) দ্বিগুণেরও বেশি হ্রাস পেয়েছে।আমাদের উপসংহারের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে NMPylation N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের পাশের চেইনের পরিবর্তে N-টার্মিনাল প্রাথমিক অ্যামাইন এ ঘটে, আমরা N3825A এবং N3825S এর প্রতিস্থাপনের সাথে উল্লেখযোগ্য অবশিষ্ট NMPylation লক্ষ্য করেছি।মজার বিষয় হল, যদি দ্বিতীয় Asn-কে Ala বা Ser দ্বারা প্রতিস্থাপিত করা হয়, তাহলে nsp9 UMPylation আরও জোরালোভাবে হ্রাস পাবে (10 বারের বেশি), যেখানে 3, 4, এবং 6 অবস্থানে Ala-এর প্রতিস্থাপন nsp9 UMPylation-এর উপর মাঝারি প্রভাব ফেলে (চিত্র 2) )5C)।ATP, CTP বা GTP (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S8) ব্যবহার করে অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে।সম্মিলিতভাবে, এই তথ্যগুলি nsp9 NMPylation-এ N2826 (nsp9-এ অবস্থান 2) এর মূল ভূমিকা নির্দেশ করে।
এনএসপি 9 এবং এনএমপিলেশনের এন-টার্মিনাসের মধ্যে কার্যকরী পারস্পরিক সম্পর্কের অতিরিক্ত প্রমাণ পাওয়ার জন্য, আমরা করোনাভাইরাস পরিবারের এনএসপি 9 সিকোয়েন্সের একটি মাল্টিপল সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট (এমএসএ) করেছি (104 এবং 113টি অবশিষ্টাংশের মধ্যে পরিবর্তিত) (এসআই পরিশিষ্ট, চিত্র S6)।মোট, বিভিন্ন স্তন্যপায়ী প্রাণী, পাখি এবং সরীসৃপ পোষকদের সংক্রামিত অর্থোকরোনাভিরিনা সাবফ্যামিলির 5 জেনারের 47টি (পরিচিত এবং পুটেটিভ) প্রজাতির মধ্যে, মোট মাত্র 8টি অবশিষ্টাংশ অপরিবর্তনীয় বলে পাওয়া গেছে।nsp9-এর সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার উপাদানগুলির মধ্যে চক্রে মোছা এবং সন্নিবেশ সহ সর্বাধিক ব্যাপক পরিবর্তনগুলি পরিলক্ষিত হয়েছে, যা পূর্ববর্তী কাঠামোগত গবেষণা (26 ??28) দ্বারা নির্ধারিত হয়েছে।nsp9-এর C-টার্মিনাল অংশের β স্ট্র্যান্ড এবং α হেলিক্সে পাঁচটি অপরিবর্তনীয় অবশিষ্টাংশ পাওয়া গেছে।তিনটি অপরিবর্তনীয় অবশিষ্টাংশ nsp9 এর N টার্মিনাসের NNE মোটিফ গঠন করে।এটি প্রকাশ করা হয়েছে যে এই মোটিফের দ্বিতীয় Asn হল একমাত্র অপরিবর্তনীয় অবশিষ্টাংশ, যা দূরবর্তীভাবে সম্পর্কিত ব্যাঙ করোনভাইরাসটির অনুমানমূলক nsp9 দ্বারা ভাগ করা হয়েছে এবং আলফালেটোভাইরাসের লেটোভিরিনা সাবফ্যামিলিতে মাইক্রোহাইলা লেটোভাইরাস 1 প্রজাতির প্রতিনিধিত্ব করে।nsp9 সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার এলিমেন্টে অবশিষ্টাংশের সংরক্ষণ ভাঁজ বা পরিচিত RNA বাঁধাই বৈশিষ্ট্য বজায় রাখার জন্য কাঠামোগত বিবেচনার দ্বারা যুক্তিযুক্ত করা যেতে পারে।যাইহোক, এই যুক্তিটি NNE সংরক্ষণের ক্ষেত্রে প্রযোজ্য বলে মনে হয় না এবং এই অধ্যয়নের আগে, ট্রাইপেপটাইড সিকোয়েন্সের পরিবর্তনকে সীমাবদ্ধ করে এমন সীমাবদ্ধতার প্রকৃতি সম্পূর্ণরূপে অস্পষ্ট ছিল।
করোনাভাইরাস প্রতিলিপিতে nsp9-NMPylation এবং NNE সংরক্ষণের গুরুত্ব নির্ধারণ করার জন্য, আমরা HCoV-229E মিউট্যান্ট তৈরি করেছি, যা nsp9 N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের একক বা ডবল প্রতিস্থাপন বহন করে, যা ইঙ্গিত করে যে nsp9 NMPylation ভিট্রোতে ক্ষতিকারক।আমরা শুরু করার আগে, আমরা এই প্রশ্নের উত্তর দেওয়ার চেষ্টা করি যে এই প্রতিস্থাপনগুলি (nsp8|9 ক্লিভেজ সাইটের কাছাকাছি) সি-টার্মিনাল pp1a অঞ্চলের প্রোটিওলাইটিক প্রক্রিয়াকরণকে প্রভাবিত করে কিনা।nsp9-এর N-টার্মিনাসে সংশ্লিষ্ট প্রতিস্থাপন সহ nsp7-11 পলিপ্রোটিন নির্মাণের একটি সেট E. coli-এ উত্পাদিত হয়েছিল এবং রিকম্বিন্যান্ট Mpro দিয়ে কাটা হয়েছিল।চারটি সাইটের প্রোটিওলাইটিক ক্লিভেজ (এনএসপি9 ফ্ল্যাঙ্কিং সাইট সহ) কোনো প্রবর্তিত প্রতিস্থাপন (এসআই অ্যাপেন্ডিক্স, চিত্র S9) দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত হয় না, এই প্রোটিনের কাঠামোগত পরিবর্তনগুলি বাদ দিয়ে যা Mpro-মধ্যস্থ nsp8|9 ক্লিভেজ (বা অন্যান্য) এর সাথে হস্তক্ষেপ করে। ওয়েবসাইট
Huh-7 কোষগুলি জিনোম-দৈর্ঘ্যের HCoV-229E RNA দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল, এনএসপি9 এন টার্মিনাসে সংরক্ষিত NNE ট্রিপেপটাইডে (N3825, N3826, এবং E3827) এনকোডিং আলা বা সার প্রতিস্থাপন, দেখায় যে বেশিরভাগ মিউটেশন মারাত্মক।আমরা N-টার্মিনাল Asn (N2835A বা N2835S) এর Ser বা Ala প্রতিস্থাপন করে ভাইরাসটিকে উদ্ধার করতে সক্ষম হয়েছিলাম, কিন্তু NNE ক্রমানুসারে (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, অন্যান্য একক এবং দ্বৈত মিউটেশনের মাধ্যমে ভাইরাসটিকে পুনরুদ্ধার করতে ব্যর্থ হয়েছি), NN3825/6SS) , E3827A) (চিত্র 5D)।
এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে টিস্যু কালচারে করোনভাইরাসগুলির প্রতিলিপি সীমাবদ্ধ (একই বা অনুরূপ), শরীরে nsp9 NMPylation সাইটগুলির প্রাকৃতিক মিউটেশনকে সীমিত করে এবং করোনভাইরাসগুলির জীবনচক্রে এই প্রতিক্রিয়াটির মূল ভূমিকাকে সমর্থন করে।
পরীক্ষা-নিরীক্ষার শেষ সেটে, আমরা C-টার্মিনাল His6 লেবেলযুক্ত SARS-CoV-2 nsp12 এবং nsp9, এবং E. coli-তে nsp12-এর দুটি মিউট্যান্ট ফর্ম তৈরি করেছি।NiRAN এবং RdRp ডোমেনে সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশগুলি যথাক্রমে পরিবর্তে Ala ব্যবহার করত (চিত্র 6A এবং SI পরিশিষ্ট, টেবিল S2)।SARS-CoV-2 nsp12-এ K4465 HCoV-229E (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S2) তে K4135-এর সাথে মিলে যায়, যা NiRAN কার্যকলাপ এবং HCoV-229E প্রতিলিপি (চিত্র 3D এবং E) এর জন্য প্রয়োজনীয় বলে প্রমাণিত হয়েছে।এই অবশিষ্টাংশটি ধমনী ভাইরাস EAV nsp9 K94 অবশিষ্টাংশের সাথেও মিলে যায়, যা পূর্বে NiRAN স্ব-ইউএমপিলেশন/সেলফ-জিএমপিলেশন (16) এর জন্য প্রয়োজনীয় বলে দেখানো হয়েছিল।চিত্র 6B-তে দেখানো হয়েছে, SARS-CoV-2 nsp12-এর UMP ট্রান্সফারেজ অ্যাক্টিভিটি nsp9 কে সাবস্ট্রেট হিসাবে ব্যবহার করে, যখন nsp12_K4465A সক্রিয় সাইট মিউট্যান্ট নিষ্ক্রিয়।RdRp মোটিফ C-এর SDD বৈশিষ্ট্যগত ক্রম-এর ডবল প্রতিস্থাপন UMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে না (চিত্র 6B), ইঙ্গিত করে যে RdRp কার্যকলাপের nsp9 UMPylation-এ সরাসরি কোনো প্রভাব নেই।CTP, GTP এবং ATP (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S10) ব্যবহার করে অনুরূপ ডেটা প্রাপ্ত হয়েছিল।সংক্ষেপে, এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে NiRAN-মধ্যস্থ nsp9 NMPylation করোনাভাইরাসে একটি রক্ষণশীল কার্যকলাপ রয়েছে যা অর্থোকরোনাভাইরাস সাবফ্যামিলির বিভিন্ন প্রজন্মের প্রতিনিধিত্ব করে।
SARS-CoV-2 nsp9-এর nsp12-মধ্যস্থিত NMPylation।(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide জেল NMPylation পরীক্ষায় ব্যবহৃত রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন দেখাচ্ছে।নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, SARS-CoV-2 nsp12-এর NiRAN ডোমেনে (K4465A) এবং RdRp ডোমেইন (DD5152/3AA) এ সক্রিয় সাইট প্রতিস্থাপন সহ একটি মিউট্যান্ট প্রোটিন ব্যবহার করা হয়েছিল।অবশিষ্ট সংখ্যা pp1ab অবস্থানের উপর ভিত্তি করে।(B) nsp9-His6 এবং [α-32P]UTP ব্যবহার করে nsp12-His6 (বন্য ধরনের [wt] এবং মিউট্যান্ট) এর সাবস্ট্রেট হিসাবে UMPylation সনাক্তকরণের অটোরেডিওগ্রাফ।লেবেলযুক্ত প্রোটিনের আণবিক ভর (কিলোডাল্টনে) বাম দিকে দেখানো হয়েছে।
নিরান ডোমেইনগুলি সাধারণত নিডোভাইরালেস (16) এ সংরক্ষিত থাকে, এটি নির্দেশ করে যে তারা নিডোভাইরাস প্রতিলিপির জন্য প্রয়োজনীয় এনজাইমেটিক প্রতিক্রিয়াগুলিকে অনুঘটক করে।এই গবেষণায়, আমরা প্রমাণ করতে সক্ষম হয়েছি যে করোনাভাইরাস এর NiRAN ডোমেইন NMP (NTP থেকে উৎপন্ন) nsp9-তে স্থানান্তর করে, একটি রহস্যময় RNA বাইন্ডিং প্রোটিন যা ভাইরাসের প্রতিলিপিতে জড়িত (26?? 29), এটিকে একটি প্রাকৃতিক লক্ষ্য হিসাবে নির্ধারণ করতে এবং করোনাভাইরাস আরটিসির অংশীদার।
NiRAN ডোমেইন তিনটি সিকোয়েন্স মোটিফ (AN, BN, এবং CN) শেয়ার করে, যেটিতে খুব কম সংখ্যক অবশিষ্টাংশ রয়েছে যা মনোফাইলেটিক কিন্তু অত্যন্ত বিভেদযুক্ত নিডোভাইরালেস অর্ডারে (8, 16) সমস্ত পরিবারে সংরক্ষিত।সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে তারা গঠনগতভাবে প্রোটিন কাইনেজ-জাতীয় প্রোটিনগুলির একটি বৃহৎভাবে অচ্যুত পরিবারের সাথে সম্পর্কিত, যাকে মূলত SelO পরিবার বলা হত (17, 19, 22, 30, 31)।সেলও-সম্পর্কিত প্রোটিনগুলির কাইনেজ ভাঁজ রয়েছে, তবে ক্লাসিক্যাল কাইনেসগুলিতে বেশ কয়েকটি সংরক্ষিত সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশের অভাব রয়েছে (22, 32)।সক্রিয় সাইটে আবদ্ধ ATP অণুগুলির বিপরীত অভিযোজনের উপর ভিত্তি করে এবং নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া দ্বারা স্থিতিশীল, SelO অনুমান করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে প্রোটিন সাবস্ট্রেটে (22) এএমপি (ফসফেটের পরিবর্তে) স্থানান্তর করার জন্য নিশ্চিত করা হয়েছিল, যখন আরেকটি ব্যাকটেরিয়া SelO-এর মতো প্রোটিন YdiU আছে সম্প্রতি Tyr এবং তার বিভিন্ন প্রোটিন সাবস্ট্রেট (33) এর অবশিষ্টাংশের সাথে UMP-এর সমযোজী সংযুক্তিকে অনুঘটক করতে দেখানো হয়েছে।
করোনাভাইরাস নিরান ডোমেনের পুটেটিভ সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশের পূর্বাভাস নিশ্চিত এবং প্রসারিত করার জন্য, আমরা করোনভাইরাস এনএসপি 12 (চিত্র 3D এবং ই এবং এসআই পরিশিষ্ট, চিত্র S3 এবং টেবিল) S1â-এ মিউটেশন বিশ্লেষণ করতে জৈব রাসায়নিক এবং বিপরীত জেনেটিক্স পদ্ধতি ব্যবহার করেছি। S4)।ডেটা দেখায় যে HCoV-229E K4135, R4178 এবং D4280 এর সাথে Ala প্রতিস্থাপন করা হলে এনটিপি γ-ফসফেটে তাদের উপস্থিতি সমর্থন করে কোষ সংস্কৃতিতে ভিট্রো এনএমপি ট্রান্সফারেজ অ্যাক্টিভিটি এবং ভাইরাসের প্রতিলিপিকরণ (চিত্র 3D এবং E এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3) দূর করে। ( K4135, R4178) এবং সক্রিয় সাইট ধাতব আয়নগুলির সমন্বয় (D4280)।K4135 (17) অবস্থানকে স্থিতিশীল করার ভবিষ্যদ্বাণী করা পাখির নেস্ট ভাইরাসের পরিসরে সংরক্ষিত গ্লুর E4145A প্রতিস্থাপন ভাইরাল প্রতিলিপি নির্মূল করার জন্য দেখানো হয়েছিল, কিন্তু আশ্চর্যজনকভাবে, ক্রিয়াকলাপটি ইন ভিট্রো এনএমপিলেশন অ্যাসে (চিত্র 3D এবং E এবং) তে ধরে রাখা হয়েছিল। SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3 এবং টেবিল S1–S4)।একই রকম পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল যখন সালমোনেলা টাইফিমুরিয়াম (E130A) (33) এর YdiU হোমোলজে সংশ্লিষ্ট প্রতিস্থাপন প্রবর্তন করা হয়েছিল।একসাথে নেওয়া, এই ডেটা অনুঘটক ফাংশনের পরিবর্তে এই সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশের নিয়ন্ত্রক ফাংশনকে সমর্থন করে।
HCoV-229E নিরান ডোমেনে (8) নেস্টোভাইরাসের সীমার মধ্যে সংরক্ষিত Phe অবশিষ্টাংশ (F4281A) প্রতিস্থাপনের ফলে ভিট্রোতে NMPylation কার্যকলাপ হ্রাস পায় এবং কোষ সংস্কৃতিতে ভাইরাসের প্রতিলিপি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায় (চিত্র 3D, E এবং SI) পরিশিষ্ট, চিত্র S3)।ডেটা এই অবশিষ্টাংশের গুরুত্বপূর্ণ নিয়ন্ত্রক ফাংশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেমন পূর্বে দেখানো সমজাতীয় DFG মোটিফ Phe অবশিষ্টাংশ।শাস্ত্রীয় প্রোটিন কাইনেসে, এটি Mg2+ বাইন্ডিং লুপের অংশ এবং মেরুদণ্ডকে একত্রিত ও নিয়ন্ত্রণ করতে সাহায্য করে???কার্যকর অনুঘটক কার্যকলাপের জন্য প্রয়োজনীয় (32, 34)।K4116 অবশিষ্টাংশের জন্য Ala এবং Arg প্রতিস্থাপন করা (preAN মোটিফে), যথাক্রমে, ভাইরাল প্রতিলিপি নির্মূল করেছে এবং, প্রত্যাশিতভাবে, ভিট্রোতে NMP ট্রান্সফারেজ কার্যকলাপের উপর ভিন্ন প্রভাব ফেলেছে, প্রবর্তিত অ্যামিনো অ্যাসিড সাইড চেইনের উপর নির্ভর করে (চিত্র 3D এবং E এবং SI পরিশিষ্টগুলি) , চিত্র S3)।কার্যকরী তথ্য কাঠামোগত তথ্যের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ইঙ্গিত করে যে এই অবশিষ্টাংশটি এটিপি ফসফেটের সাথে একটি মিথস্ক্রিয়া স্থাপন করেছে (17)।অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাস পরিবারের NiRAN ডোমেনে, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116-এর অবস্থান Lys, Arg বা His (8) দ্বারা দখল করা হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে এই নির্দিষ্ট অবশিষ্টাংশের কার্যকরী সীমাবদ্ধতা শিথিল করা হয়েছে।D4188A এবং D4283A এর প্রতিস্থাপন এনজাইমের কার্যকলাপকে দূর করে বা দৃঢ়ভাবে হ্রাস করে এবং ভাইরাসের প্রতিলিপি নির্মূল করে (চিত্র 3)।এই দুটি অবশিষ্টাংশ বেশিরভাগ (কিন্তু সব নয়) নেস্টেড ভাইরাসে (8) সংরক্ষণ করা হয়, যা একটি গুরুত্বপূর্ণ পরিবার-নির্দিষ্ট তবে সম্ভবত অনুঘটক নয় এমন ফাংশন নির্দেশ করে।অন্যান্য বেশ কিছু Lys এবং Asp অবশিষ্টাংশের Ala প্রতিস্থাপন (K4113A, D4180A, D4197A এবং D4273A) যেগুলি করোনাভাইরিডে বা অন্যান্য নেস্টিওভিরিডে পরিবারে সংরক্ষিত নয় (8) নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।প্রত্যাশিত হিসাবে, এই প্রতিস্থাপনগুলি বেশিরভাগ ক্ষেত্রে সহনীয়, কিছু ক্ষেত্রে এনজাইম কার্যকলাপ এবং ভাইরাল প্রতিলিপিতে সামান্য হ্রাস সহ (চিত্র 3 এবং এসআই পরিশিষ্ট, চিত্র S3)।সামগ্রিকভাবে, করোনভাইরাস মিউটেজেনেসিস ডেটা EAV NiRAN-RdRp (16) এর স্ব-GMP এবং বিপরীত জেনেটিক্স ডেটার সাথে খুব সামঞ্জস্যপূর্ণ, যার মধ্যে EAV nsp9 (করোনাভাইরাস nsp12 অর্থলগ) অবশিষ্টাংশ K94 (HCoV- 229E K4135 এর সাথে সম্পর্কিত), গুরুত্বপূর্ণ ফাংশনগুলি R124 (R4178 এর সাথে সম্পর্কিত), D132 (D4188 এর সাথে সম্পর্কিত), D165 (D4280 এর সাথে সম্পর্কিত), F166 (F4281 এর সাথে সম্পর্কিত)।উপরন্তু, HCoV-229E মিউটাজেনেসিস ডেটা পূর্বে রিপোর্ট করা SARS-CoV রিভার্স জেনেটিক্স ডেটা (16) থেকে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং সম্প্রসারিত হয়েছে, ঠিক যেমনটি সংশ্লিষ্ট CN মোটিফ Phe-to-Ala মিউট্যান্ট SARS-CoV_nsp12-এর জন্য পর্যবেক্ষণের মতো। বর্ণিত ফেনোটাইপ -F219A এবং HCoV-229E_F4281A (চিত্র 3 D এবং E এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3 এবং টেবিল S1-S4)।
EAV অর্থলগস (16) এর সাথে তুলনা করে, যাদের UTP এবং GTP (স্ব-NMPylation প্রতিক্রিয়ায়) এর জন্য স্পষ্ট পছন্দ রয়েছে, আমাদের গবেষণা দেখায় যে করোনভাইরাস নিরান ডোমেন (HCoV-229E এবং SARS-CoV-2 দ্বারা উপস্থাপিত) কার্যকরভাবে হতে পারে। চারটি এনএমপি স্থানান্তরিত করা হয়েছে, যদিও ইউএমপির জন্য সামান্য পছন্দ রয়েছে (চিত্র 1 এবং 3)।নির্দিষ্ট NTP কো-সাবস্ট্রেটের তুলনামূলকভাবে কম নির্দিষ্টতা সম্প্রতি রিপোর্ট করা SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 সুপার কম্পোজিট কাঠামোর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে ADP-Mg2+ NiRAN-এর সক্রিয় সাইটে আবদ্ধ, কিন্তু অ্যাডেনিন অংশের সাথে নয়। নির্দিষ্ট মিথস্ক্রিয়া গঠনের (17)আমাদের গবেষণায়, NMPylation বিক্রিয়ায় ব্যবহৃত নিউক্লিওটাইডের প্রকারের মিউট্যান্ট প্রোটিনের কার্যকলাপের উপর কোন পার্থক্যমূলক প্রভাব নেই (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3), ইঙ্গিত করে যে এই অবশিষ্টাংশগুলির কোনটিই একটি নির্দিষ্ট নিউক্লিওবেসের বাঁধনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত নয়।করোনাভাইরাস এবং ধমনী ভাইরাসের NiRAN ডোমেনে পরিলক্ষিত বিভিন্ন NTP সহ-সাবস্ট্রেট পছন্দগুলির কাঠামোগত ভিত্তি এবং সম্ভাব্য জৈবিক তাত্পর্য অধ্যয়ন করা বাকি আছে;সেগুলি সত্য হতে পারে বা তাদের নিজ নিজ অধ্যয়নের সীমাবদ্ধতার কারণে হতে পারে৷বর্তমানে, এটি উড়িয়ে দেওয়া যায় না যে ধমনী ভাইরাস NiRAN ডোমেনের সম্ভাব্য NMPylator কার্যকলাপের (আগের বৈশিষ্ট্যযুক্ত স্ব-NMPylation কার্যকলাপের তুলনায়) একটি ভিন্ন সহ-সাবস্ট্রেট পছন্দ রয়েছে, এই বিবেচনায় যে ধমনী এবং করোনাভাইরাসের মধ্যে মিল রয়েছে। NiRAN ডোমেইন তার সীমায়।ক্রম-ভিত্তিক তুলনা (16)।pseudokinase SelO, যা Mg2+ একটি cofactor হিসাবে ব্যবহার করে, করোনাভাইরাস এবং ধমনী ভাইরাস NiRAN-এর কার্যকলাপ Mn2+ (16) (চিত্র 3C এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S1) এর উপর নির্ভরশীল।UTP-এর জন্য Mn2+ নির্ভরতা এবং সুস্পষ্ট পছন্দ হল প্রোটিন NMPylators-এর একটি অস্বাভাবিক বৈশিষ্ট্য, এবং এটি সম্প্রতি সালমোনেলা টাইফিমুরিয়ামের YdiU প্রোটিনে নিশ্চিত করা হয়েছে, যা স্ট্রেস ইনডাকশন সেল ATP পুল থেকে কোষকে রক্ষা করার জন্য কঠোর Mn2+-নির্ভর প্রোটিন চ্যাপেরোন UMPylation কে অনুঘটক করে। 33)।
করোনাভাইরাস NiRAN ডোমেন এবং সেলুলার প্রোটিন কাইনেস (17, 19) এর মধ্যে সম্প্রতি বর্ণিত কাঠামোগত মিল এই গবেষণায় আমরা রিপোর্ট করেছি যে অন্যান্য প্রোটিনগুলির সাথে NMP-কে সমন্বিতভাবে লিঙ্ক করার জন্য NiRAN-এর ক্ষমতার জন্য অতিরিক্ত সহায়তা প্রদান করে।আমরা HCoV-229E ORF1a দ্বারা এনকোড করা প্রোটিনগুলির উপর সম্ভাব্য নিরান লক্ষ্যগুলির জন্য আমাদের অনুসন্ধানকে কেন্দ্রীভূত করেছি, যা প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে RTC-এর ORF1b-এনকোডেড প্রতিলিপি (12, 35) সহায়তা করতে পরিচিত।আমাদের পরীক্ষাগুলি nsp9 (চিত্র 2) এর কার্যকর এবং নির্দিষ্ট এনএমপিলেশনের জন্য চূড়ান্ত প্রমাণ সরবরাহ করে।যদি লক্ষ্য প্রোটিন একটি মোলার অতিরিক্ত ব্যবহার করা হয় যা এনজাইমের (nsp12) তুলনায় 8 থেকে 10 গুণ বেশি, এটি নিশ্চিত করা হয় যে nsp9 সম্পূর্ণরূপে (মনো) NMPized (চিত্র 4)।আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে nsp12 এবং nsp9 এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া স্বল্পস্থায়ী এবং nsp9 এর সাথে একটি স্থিতিশীল কমপ্লেক্স গঠন করবে না (অন্যান্য RTC সাবইউনিটের অনুপস্থিতিতে)।এই উপসংহারটি SARS-CoV প্রোটিওম (35) এর প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া গবেষণা দ্বারা সমর্থিত।MS বিশ্লেষণ nsp9 এর N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের প্রাথমিক অ্যামাইনকে NMPylation সাইট (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S5) হিসাবে চিহ্নিত করেছে।ফসফরামিডেট বন্ড এবং এন-টার্মিনাল অ্যামিনো গ্রুপের গঠন NiRAN-মধ্যস্থ এনএমপিলেশন কার্যকলাপকে সিউডোমোনাস সিরিঞ্জে সেলও-মধ্যস্থতামূলক এএমপিলেশন প্রতিক্রিয়া থেকে আলাদা করে, যা Ser, Thr, বা Tyr অবশিষ্টাংশে O-লিঙ্কড এএমপি গঠনকে অনুঘটক করে। 22), এবং S. typhimurium YdiU গঠন করে ও-লিঙ্কড (টাইর সহ) এবং এন-লিঙ্কড (তার সাথে) পেপটাইড-ইউএমপি অ্যাডাক্ট।প্রোটিনের সেলও পরিবারের সীমিত তথ্য ইঙ্গিত করে যে এই বৃহৎ প্রোটিন পরিবারের সদস্যরা পেপটাইড-এনএমপি অ্যাডাক্ট গঠনে ব্যাপকভাবে ভিন্ন।এটি একটি আকর্ষণীয় পর্যবেক্ষণ যা আরও অধ্যয়নের দাবি রাখে।
এই গবেষণায় প্রাপ্ত তথ্য আমাদের অনুমান করতে পরিচালিত করেছে যে nsp9-এর NMPylation একটি বিনামূল্যে N-টার্মিনাস প্রয়োজন।ভাইরাল রেপ্লিকেশনের প্রেক্ষাপটে, এটি Mpro এবং pp1ab দ্বারা মধ্যস্থতা করা রেপ্লিকেস পলিপ্রোটিন pp1a-এ nsp8|nsp9 প্রসেসিং সাইটের প্রোটিওলাইটিক ক্লিভেজ দ্বারা সরবরাহ করা হবে।বেশিরভাগ করোনাভাইরাসে, এই নির্দিষ্ট সাইট (HCoV-229E-তে VKLQ|NNEI) এবং অন্যান্য সমস্ত করোনভাইরাস এমপ্রো ক্লিভেজ সাইটগুলির মধ্যে পার্থক্য হল Asn (অন্য একটি ছোট অবশিষ্টাংশের পরিবর্তে, যেমন আলা, সার বা গ্লাই) P1â দখল করে???অবস্থান (36)।প্রারম্ভিক গবেষণায় প্রাপ্ত পেপটাইড ক্লিভেজ ডেটা দেখায় যে nsp8|nsp9 সাইটের ক্লিভেজ দক্ষতা অন্যান্য সাইটের তুলনায় কম ছিল, ইঙ্গিত করে যে 1) এই নির্দিষ্ট সাইটের সি-টার্মিনালের সময়মত সমন্বিত প্রক্রিয়াকরণে একটি নিয়ন্ত্রক ভূমিকা থাকতে পারে pp1a অঞ্চল, বা 2) ভাইরাস প্রতিলিপিতে বিশেষ সংরক্ষিত nsp9 N-টার্মিনাসের ভূমিকা (37)।আমাদের তথ্য (চিত্র 5A) দেখিয়েছে যে বাস্তব N-টার্মিনাল ক্রম বহনকারী nsp9 এর রিকম্বিন্যান্ট ফর্মটি কার্যকরভাবে nsp12 দ্বারা NMPাইজ করা হয়েছিল।এন-টার্মিনাল ফ্ল্যাঙ্কিং সিকোয়েন্স ফ্যাক্টর Xa (nsp9-His6; SI অ্যাপেন্ডিক্স, টেবিল S1) বা Mpro-মিডিয়াটেড ক্লিভেজ (nsp7-11-His6; চিত্র 5A এবং SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1) দ্বারা সরানো হয়েছিল।গুরুত্বপূর্ণভাবে, nsp9-ধারণকারী অগ্রদূত nsp7-11-His6 nsp12-এর NMPylation-এর প্রতিরোধ দেখিয়েছে, যা আমাদের ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ইঙ্গিত করে যে nsp9-NMP অ্যাডাক্ট এন-টার্মিনাল প্রাইমারি অ্যামাইন (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S5) এর মাধ্যমে গঠিত হয়েছে। .NiRAN সাবস্ট্রেটের নির্দিষ্টতা সম্পর্কে গভীরভাবে বোঝার জন্য, আমরা তখন nsp9 এর সংলগ্ন N-টার্মিনাল অবশিষ্টাংশের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি।অন্যান্য প্রোটিনের অনুপস্থিতিতে, তারা গঠনগতভাবে নমনীয়, এনএসপি 9 (26 28, 38) এর লেবেলবিহীন আকারে তাদের সনাক্ত করা থেকে বাধা দেয়, তাদের সীমিত প্রাকৃতিক বৈচিত্র নির্দেশ করে এটি গুরুত্বপূর্ণ ক্রম-নির্দিষ্ট (সেকেন্ডারি কাঠামো সম্পর্কিত নয়) এর কারণে। nsp9 N-টার্মিনাল ফ্র্যাগমেন্টের কাজ।এই অঞ্চলে সংরক্ষিত অবশিষ্টাংশের আলা প্রতিস্থাপন (চিত্র 5C এবং D এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S8) প্রকাশ করে যে N3826 ভিট্রোতে nsp9 NMPylation-এর জন্য অপরিহার্য, যেখানে N3825A এবং E3827A প্রতিস্থাপন NMPylation হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে, এবং P3820 সাবস্টিটিউশনগুলি P3820 করে না। .স্পষ্টতই nsp9 NMPylation প্রভাবিত করে।যদিও N-টার্মিনাল Asn (N3825A, N3825S) এর প্রতিস্থাপনের nsp9 NMPylation এবং কোষ সংস্কৃতিতে ভাইরাসের প্রতিলিপির উপর একটি মাঝারি প্রভাব রয়েছে (চিত্র 5C এবং D), N-টার্মিনাল 3825-NN dipe থেকে Asn অবশিষ্টাংশের ক্রম অপসারণ প্রমাণিত যে এটি ভাইরাসের জন্য প্রাণঘাতী, ইঙ্গিত করে যে এন-টার্মিনাসে অন্য অবশিষ্টাংশের আগে একটি Asn অবশিষ্টাংশ প্রয়োজন, বিশেষত Asn, যদিও মনে হয় অনুরূপ অবশিষ্টাংশের প্রতিস্থাপন আংশিকভাবে সহ্য করা যেতে পারে (চিত্র 5B, C, এবং D)।আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে 3825-NN ডাইপেপটাইড, বিশেষ করে করোনাভাইরাস পরিসরের মধ্যে সংরক্ষিত এবং প্রয়োজনীয় N3826 অবশিষ্টাংশ (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S6), NiRAN-এর সক্রিয় সাইটে nsp9 N-টার্মিনাসের সঠিক বাইন্ডিং এবং ওরিয়েন্টেশন নিশ্চিত করে।
সমস্ত সাবফ্যামিলির সংরক্ষিত গ্লুর জন্য আলা (E3827A) প্রতিস্থাপন করা ভিট্রোতে nsp9 NMPylation বজায় রাখে কিন্তু কোষ সংস্কৃতিতে ভাইরাসের জন্য প্রাণঘাতী (চিত্র 5C এবং D), এই অবশিষ্টাংশের অতিরিক্ত ফাংশন নির্দেশ করে, উদাহরণস্বরূপ, মূল মিথস্ক্রিয়ায় (NMPylated বা অপরিবর্তিত ) nsp9 N-টার্মিনাস এবং ভাইরাসের প্রতিলিপিতে জড়িত অন্যান্য কারণ।Nsp9 মিউটেশনগুলি nsp9 এর প্রোটিওলাইটিক প্রক্রিয়াকে প্রভাবিত করেনি বা কোনও সংলগ্ন nsps (39) (SI পরিশিষ্ট, চিত্র S9), ইঙ্গিত করে যে পরিলক্ষিত বেশ কয়েকটি nsp9 মিউটেশনের প্রাণঘাতী ফেনোটাইপগুলি C প্রোটিওলাইটিক প্রক্রিয়া-টার্মিনাল pp1a এরিয়ার ডিসরেগুলেশনের কারণে ঘটেনি। .
উপরের তথ্যগুলি প্রমাণ দেয় যে pp1a/pp1ab-এ nsp8|9 ক্লিভেজ সাইটের Mpro-মধ্যস্থিত চিকিত্সার পরে, nsp9-এর N-টার্মিনাস UMPylated (বা অন্য NMP দিয়ে আংশিকভাবে পরিবর্তিত) হতে পারে।উপরন্তু, nsp9 এর N-টার্মিনাসের চমৎকার সংরক্ষণ (করোনাভাইরাস পরিবারে একক এবং অপরিবর্তনীয় Asn অবশিষ্টাংশ সহ) এবং এই গবেষণায় প্রাপ্ত বিপরীত জেনেটিক্স ডেটা (চিত্র 3E এবং 5D) আমাদের এই সিদ্ধান্তে পৌঁছেছে যে বর্ণিত nsp9 NMPylation জৈবিকভাবে সম্পর্কিত এবং করোনাভাইরাস প্রতিলিপির জন্য অপরিহার্য।এই পরিবর্তনের কার্যকরী ফলাফলগুলি অধ্যয়ন করা বাকি আছে, উদাহরণস্বরূপ, পূর্বে বর্ণিত (অ-নির্দিষ্ট) nsp9 (অপরিবর্তিত ফর্ম) RNA বাঁধাই কার্যকলাপ (2628) সম্পর্কিত।N-টার্মিনাল NMPylation প্রোটিন বা RNA সাবস্ট্রেটের সাথে nsp9-এর মিথস্ক্রিয়া বা বিভিন্ন চার-স্তরের সমাবেশের গঠনকেও প্রভাবিত করতে পারে।এগুলি কাঠামোগত গবেষণায় পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে এবং করোনাভাইরাস প্রতিলিপির সাথে কার্যকরীভাবে সম্পর্কিত বলে নিশ্চিত করা হয়েছে, যদিও বিশেষত এই পরিবর্তনের ক্ষেত্রে (26- ââ29, 40) এর অনুপস্থিতিতে।
যদিও করোনভাইরাস নিরান ডোমেনের লক্ষ্যমাত্রার নির্দিষ্টতা এখনও আরও বিশদে চিহ্নিত করা দরকার, আমাদের ডেটা দেখায় যে করোনভাইরাস নিরান ডোমেনের প্রোটিন লক্ষ্য নির্দিষ্টতা খুব সংকীর্ণ।যদিও সমস্ত নিডোভাইরাস পরিবারের নিরান ডোমেনে মূল সক্রিয় সাইটের অবশিষ্টাংশ (8, 16) সংরক্ষণ এই প্রোটিনগুলির সংরক্ষিত NMPylator এর কার্যকলাপকে দৃঢ়ভাবে সমর্থন করে, এই ডোমেনের সাবস্ট্রেট বাঁধাই পকেট অবশিষ্টাংশগুলির পরিচয় সংরক্ষণ এবং সংরক্ষণ বৈশিষ্ট্যযুক্ত হতে হবে। , এবং Nidovirales উদ্দেশ্যে বিভিন্ন পরিবারের মধ্যে পার্থক্য হতে পারে।একইভাবে, অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাসগুলির প্রাসঙ্গিক লক্ষ্যগুলি এখনও নির্ধারণ করা হয়নি।এগুলি nsp9 বা অন্যান্য প্রোটিনের দূরবর্তী অর্থলগ হতে পারে, কারণ পাঁচটি প্রতিলিপি ডোমেনের বাইরের ক্রমগুলি যা সাধারণত নেস্টেড ভাইরাসগুলিতে সংরক্ষিত থাকে সেগুলি কম সংরক্ষিত (8), যার মধ্যে Mpro এবং NiRAN এর মধ্যে জিনোম অ্যারে রয়েছে, তাদের মধ্যে, nsp9 অবস্থিত করোনা ভাইরাস.
উপরন্তু, আমরা বর্তমানে নিরান ডোমেনের অতিরিক্ত (সেলুলার সহ) লক্ষ্য থাকার সম্ভাবনাকে উড়িয়ে দিতে পারি না।এই ক্ষেত্রে, এটি উল্লেখ করা উচিত যে এই উদীয়মান প্রোটিন NMPylators (NMPylators) (30, 31) এর ব্যাকটেরিয়া হোমোলোগগুলির "মাস্টার রেগুলেটর" আছে বলে মনে হচ্ছে?এনএমপি বিভিন্ন ধরণের সেলুলার প্রোটিনগুলিকে তাদের নিম্নধারার ক্রিয়াকলাপগুলিকে নিয়ন্ত্রিত বা নির্মূল করতে মডিউল করে, যার ফলে সেলুলার স্ট্রেস প্রতিক্রিয়া এবং রেডক্স হোমিওস্টেসিস (22, 33) এর মতো বিভিন্ন জৈবিক প্রক্রিয়াগুলিতে ভূমিকা পালন করে।
এই গবেষণায় (চিত্র 2 এবং 4 এবং SI পরিশিষ্ট, চিত্র S3 এবং S5), আমরা প্রমাণ করতে সক্ষম হয়েছি যে nsp12 UMP (NMP) অংশটিকে nsp9-এ একটি একক (সংরক্ষিত) অবস্থানে স্থানান্তর করেছে, যখন অন্যান্য প্রোটিনগুলি এনএসপি-তে পরিবর্তন করা হয়নি। শর্তাধীনে ব্যবহৃত, ভাল-সংজ্ঞায়িত (আলগা না হয়ে) স্তরের নির্দিষ্টতা সমর্থিত।এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, N-টার্মিনাল nsp9 NMPylation-এর সাথে তুলনা করে, nsp12-এর নিজস্ব NMPylation কার্যকলাপ খুবই কম, এটি সনাক্তকরণের জন্য দীর্ঘ অটোরাডিওগ্রাফি এক্সপোজার সময় প্রয়োজন, এবং nsp12 ঘনত্বে 10-গুণ বৃদ্ধি ব্যবহার করা হয়।উপরন্তু, আমাদের MS বিশ্লেষণ nsp12-এর NMPylation-এর প্রমাণ দিতে ব্যর্থ হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে NiRAN ডোমেন স্ব-NMPylation হল (সর্বোচ্চ) একটি গৌণ কার্যকলাপ।যাইহোক, এটি লক্ষ করা উচিত যে অন্যান্য গবেষণায় প্রাথমিক প্রমাণ দেওয়া হয়েছে যে ব্যাকটেরিয়া NMPylator এর স্ব-AMPylation অবস্থা অন্যান্য প্রোটিন সাবস্ট্রেটগুলিতে তাদের NMPylation কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে (22, 33)।তাই, C-টার্মিনাল RdRp ডোমেনের ভাঁজ করার উপর প্রস্তাবিত চ্যাপেরোন-সদৃশ প্রভাব সহ EAV nsp9 (16) এবং করোনভাইরাস nsp12 (এই গবেষণা) এর জন্য রিপোর্ট করা স্ব-NMPylation কার্যকলাপের সম্ভাব্য কার্যকরী প্রভাবগুলি তদন্ত করার জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। 16))।
পূর্বে, নিডোভাইরাল নিরান ডোমেনের সম্ভাব্য ডাউনস্ট্রিম ফাংশন সম্পর্কিত বেশ কয়েকটি হাইপোথিসিস বিবেচনা করা হয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে আরএনএ লিগেস, আরএনএ-ক্যাপড গুয়ানিলেট ট্রান্সফারেজ এবং প্রোটিন প্রাইমিং অ্যাক্টিভিটি (16), কিন্তু তাদের কোনটিই উপলভ্য ডাউনস্ট্রিম ফাংশনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ নয়।অতিরিক্ত অনুমান না করে নিম্নলিখিত অবস্থানে প্রাপ্ত তথ্য ঠিক একই সময়ে।এই গবেষণায় প্রাপ্ত তথ্যগুলি সবচেয়ে সামঞ্জস্যপূর্ণ (কিন্তু প্রমাণ করতে পারে না) যে NiRAN ডোমেন প্রোটিন-প্ররোচিত RNA সংশ্লেষণের সূচনার সাথে জড়িত।এটি আগে বিশ্বাস করা হয়েছিল যে 5 সালে নিরান ডোমেনের কার্যকারিতা?²-আরএনএ ক্যাপিং বা আরএনএ লিগেশন প্রতিক্রিয়াগুলি এগুলি এবং অন্যান্য ডেটার সমর্থন দ্বারা প্রভাবিত হয় না।অতএব, উদাহরণস্বরূপ, NiRAN-এর সক্রিয় সাইটটিকে সাধারণ ভিত্তি হিসাবে সংরক্ষিত Asp-কে জড়িত বলে মনে করা হয় (Pseudomonas syringae SelO-তে D252; HCoV-229E pp1ab-তে D4271; SARS-CoV-2 nsp12-এ D208) (SI পরিশিষ্ট, চিত্র 2) )S2) (17, 22, 33), যখন এটিপি-নির্ভর আরএনএ লিগেজ এবং আরএনএ ক্যাপিং এনজাইমে অনুঘটকটি সমযোজী এনজাইম-(লাইসিল-এন)-এনএমপি মধ্যবর্তী দ্বারা পরিচালিত হয়, যার মধ্যে একটি অ-পরিবর্তিত লাইস অবশিষ্টাংশ জড়িত থাকে ( 41)।এছাড়াও, সংরক্ষিত প্রোটিন লক্ষ্যগুলির জন্য করোনভাইরাস NiRAN-এর উল্লেখযোগ্য সিকোয়েন্স-ভিত্তিক নির্দিষ্টতা এবং NTP সহ-সাবস্ট্রেট (UTP পছন্দ করে) জন্য শিথিল বৈশিষ্ট্য NiRAN-মধ্যস্থ ক্যাপিং এনজাইম বা RNA ligase-এর মতো ফাংশনের বিরোধিতা করে।
স্পষ্টতই, যাচাই করার জন্য প্রচুর অতিরিক্ত কাজের প্রয়োজন এবং, যদি প্রমাণিত হয়, প্রোটিন-প্ররোচিত আরএনএ সংশ্লেষণে nsp9-UMP (nsp9-NMP) এর সম্ভাব্য ভূমিকা সম্পর্কে বিশদভাবে বর্ণনা করুন, যা বেশ কয়েকটি আকর্ষণীয় কিন্তু (এখন পর্যন্ত) পূর্বে রিপোর্ট করা রিপোর্টগুলিকে সংযুক্ত করবে। .বিচ্ছিন্ন পর্যবেক্ষণ।উদাহরণস্বরূপ, এটি নির্ধারণ করা হয়েছে যে করোনভাইরাস-এর নেগেটিভ-স্ট্র্যান্ড RNA-এর শেষ একটি অলিগো(U) স্ট্র্যান্ড (42, 43) দিয়ে শুরু হয়।এই পর্যবেক্ষণটি এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে নেতিবাচক-স্ট্র্যান্ড RNA-এর সংশ্লেষণটি nsp9-এর UMPylated ফর্মটিকে পলি(A) টেইলের (ট্রিগার) সাথে আবদ্ধ করার মাধ্যমে শুরু হয়, যা এর RNA বাঁধাই দ্বারা প্রচারিত হতে পারে কার্যকলাপ এবং/অথবা মিথস্ক্রিয়া। আরেকটি RTC প্রোটিন।nsp9 দ্বারা প্রদত্ত UMP অংশটি তারপর nsp7/8/nsp12-মধ্যস্থ অলিগোরিডিলেশনের জন্য একটি "প্রাইমার" হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে, জিনোমিক RNA-তে 3??²-পলি(A) লেজ বা অন্য একটি অলিগো (A)-যুক্ত ক্রম ব্যবহার করে পিকোর্নাভাইরাস ভিপিজি প্রোটিন (44) এর জন্য প্রতিষ্ঠিত প্রক্রিয়ার অনুরূপ একটি টেমপ্লেট হিসাবে কাজ করে।প্রস্তাবটি যদি "নন-নরমেটিভ" হয়????(প্রোটিন-প্ররোচিত) নেতিবাচক-স্ট্র্যান্ড আরএনএ সংশ্লেষণের সূচনা পর্যবেক্ষণগুলির একটি লিঙ্ক প্রদান করে, যা ইঙ্গিত করে যে করোনভাইরাস নেগেটিভ-স্ট্র্যান্ড আরএনএ এর শেষের দিকে UMP (UTP-এর পরিবর্তে) রয়েছে (42), যা ইঙ্গিত হিসাবে বিবেচিত হয় যে নিউক্লিক অ্যাসিড ডাইসার একটি অজানা ইউরিডিন-নির্দিষ্ট এন্ডোনিউক্লিজ দ্বারা শেষ ফসফরিলেটেড ক্লিভ করে।নিশ্চিত হলে, এই নিউক্লিক অ্যাসিড হাইড্রোলাইটিক ক্রিয়াকলাপটি ন্যাসেন্ট নেগেটিভ স্ট্র্যান্ডের 5 ² প্রান্ত থেকে nsp9-এর অলিগোমেরিক UMPylated ফর্মকে মুক্তি দিতে সাহায্য করতে পারে।প্রোটিন প্রাইমিংয়ে nsp9-এর সম্ভাব্য ভূমিকা পূর্ববর্তী বিপরীত জেনেটিক্স স্টাডির সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা দেখিয়েছে যে nsp9 (এবং nsp8) করোনাভাইরাস জিনোমের 3 প্রান্তের কাছে সংরক্ষিত cis-অভিনয় RNA উপাদানের সাথে সমালোচনামূলক এবং বিশেষভাবে যোগাযোগ করে।45)।এই প্রতিবেদন অনুসারে, এই পূর্ববর্তী পর্যবেক্ষণগুলি এখন আরও গবেষণার মাধ্যমে পুনরায় পরীক্ষা এবং প্রসারিত করা যেতে পারে।
সংক্ষেপে, আমাদের ডেটা N-টার্মিনাসে RdRp-এর সাথে লিঙ্কযুক্ত একটি মালিকানা নেস্টেড ভাইরাস এনজাইম ট্যাগের নির্দিষ্ট কার্যকলাপ নির্ধারণ করে।করোনাভাইরাসে, এই নতুন আবিষ্কৃত NiRAN-মধ্যস্থ UMPylator/NMPylator কার্যকলাপ Mn2+ এবং সংলগ্ন Asn অবশিষ্টাংশের উপর নির্ভর করতে এবং N-টার্মিনাল প্রাইমারি অ্যামাইনের সাথে (নিম্ন-শক্তি) ফসফরামিডেট বন্ড গঠনের জন্য ব্যবহৃত হয়।nsp8|9 ক্লিভেজ সাইটে Mpro-মিডিয়াটেড ক্লিভেজের মাধ্যমে, nsp9 টার্গেট NMPylation-এর জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে, যা প্রোটিজ এবং NiRAN ডোমেনের মধ্যে কার্যকরী সংযোগ নির্দেশ করে, যা RdRp পর্যন্ত প্রসারিত।SARS-CoV-2 সহ দুটি করোনভাইরাস থেকে প্রাপ্ত ডেটার সাথে মিলিত nsp12 NiRAN সক্রিয় সাইট এবং nsp9 লক্ষ্যে মূল অবশিষ্টাংশের সংরক্ষণ, শক্তিশালী প্রমাণ দেয় যে nsp9 NMPylation একটি করোনভাইরাস রক্ষণশীল বৈশিষ্ট্যগুলিও ভাইরাসের প্রতিলিপির একটি মূল পদক্ষেপ।উপলব্ধ ডেটা আমাদের এই উপসংহারে নিয়ে যায় যে প্রোটিন-প্ররোচিত আরএনএ সংশ্লেষণে এনএসপি 9 এর এনএমপিলাইটেড ফর্মের নির্দিষ্ট ভূমিকা করোনাভাইরাস এবং অন্যান্য নেস্টেড ভাইরাসগুলির জন্য একটি যুক্তিসঙ্গত দৃশ্যকল্প, এবং নিরান অন্যান্য অজ্ঞাত প্রোটিনকেও লক্ষ্য করতে পারে।ভাইরাস নিয়ন্ত্রণ করুন।হোস্ট মিথস্ক্রিয়া.যদি নিশ্চিত করা হয়, ভাইরাল RNA সংশ্লেষণে প্রোটিন প্রাইমারের সম্পৃক্ততা Mpro/3CLpro এবং RdRp ডোমেনগুলির পূর্বে শনাক্ত করা করোনাভাইরাস এবং পিকর্নাভাইরাস-সদৃশ সুপারগ্রুপ (9) এর মধ্যে অনুক্রমের সখ্যতা বাড়িয়ে তুলবে, যেটি এখন সম্প্রতি প্রতিষ্ঠিত পিসোনিভাইরাইটস-এ একীভূত হয়েছে। 46) বিভাগে।
আমাদের ডেটা আরও দেখায় যে এই গবেষণায় চিহ্নিত মৌলিক, নির্বাচনী এবং রক্ষণশীল এনজাইম ক্রিয়াকলাপগুলি অ্যান্টিভাইরাল ওষুধের লক্ষ্য হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।যে যৌগগুলি NiRAN-এর সক্রিয় সাইটে সংরক্ষিত nsp9 N-টার্মিনাসের বাঁধাইয়ে (এবং পরবর্তী পরিবর্তন) হস্তক্ষেপ করে সেগুলিকে কার্যকর এবং বহুমুখী অ্যান্টিভাইরাল ওষুধে বিকশিত করা যেতে পারে, যা বিভিন্ন (সাব) জেনাস সংক্রমণের প্রাণী এবং মানব করোনাভাইরাসগুলির চিকিত্সার জন্য উপযুক্ত। SARS-CoV-2 এবং মিডল ইস্ট রেসপিরেটরি সিনড্রোম করোনাভাইরাস সহ।
এই গবেষণায় উত্পাদিত করোনভাইরাস প্রোটিনের কোডিং সিকোয়েন্সটি RT-PCR দ্বারা RNA ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল HCoV-229E দ্বারা সংক্রামিত Huh-7 বা SARS-CoV-2 দ্বারা সংক্রামিত Vero E6 থেকে বিচ্ছিন্ন, এবং স্ট্যান্ডার্ড ক্লোনিং পদ্ধতি ব্যবহার করে ঢোকানো হয়েছিল।pMAL-c2 (নিউ ইংল্যান্ড বায়োলজিক্যাল ল্যাবরেটরি) বা PASK3-Ub-CHis6 (47) এক্সপ্রেশন ভেক্টর (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1 এবং S2)।পিসিআর-ভিত্তিক সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস (48) দ্বারা একক কোডন প্রতিস্থাপন চালু করা হয়েছিল।MBP ফিউশন প্রোটিন তৈরি করতে, E. coli TB1 কোষগুলিকে উপযুক্ত pMAL-c2 প্লাজমিড গঠন (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1) দিয়ে রূপান্তরিত করা হয়েছিল।ফিউশন প্রোটিন অ্যামাইলোজ অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং ফ্যাক্টর Xa দিয়ে ক্লিভ করা হয়েছিল।পরবর্তীকালে, সি-টার্মিনাল হিস6-ট্যাগযুক্ত প্রোটিনটি পূর্বে বর্ণিত (49) হিসাবে নি-ইমোবিলাইজড মেটাল অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি (Ni-IMAC) দ্বারা শুদ্ধ করা হয়েছিল।ubiquitin ফিউশন প্রোটিন তৈরি করতে, E. coli TB1 কোষগুলি উপযুক্ত pASK3-Ub-CHis6 প্লাজমিড গঠন (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1 এবং S2) এবং pCGI প্লাজমিড DNA এনকোডিং ubiquitin-নির্দিষ্ট C-টার্মিনাল হাইড্রোলেজ 1 (Ubp1) ব্যবহার করেছে।রূপান্তর (47)।সি-টার্মিনাল His6-ট্যাগযুক্ত করোনভাইরাস প্রোটিন পূর্বে বর্ণিত হিসাবে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল (50)।
HCoV-229E nsp12-His6 এর স্ব-NMPylation পরীক্ষা EAV nsp9 (16) এ বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল।সংক্ষেপে, nsp12-His6 (0.5 µM) এ রয়েছে 50 mM 4-(2-হাইড্রোক্সিইথাইল)-1-পাইপরাজিনেথানেসালফোনিক অ্যাসিড (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer, 25 মিমি নির্দিষ্ট NTP এবং 0.17 µM মিলেছে [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য।nsp12-মধ্যস্থ nsp9 NMPylation-এর অন্যান্য সমস্ত (মানক) NMPylation অ্যাসে, প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি নিম্নরূপ সমন্বয় করা হয়: 50 mM HEPES-KOH (pH08) এর উপস্থিতিতে nsp12-His6 (0.05 µM) এবং nsp9-His6 (4 µM)। ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM নির্দেশিত NTP, এবং 0.17 µM মিলেছে [α32-P]NTP।30 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10 মিনিটের জন্য ইনকিউব করার পরে, প্রতিক্রিয়া নমুনাটি SDS-PAGE নমুনা বাফারের সাথে মিশ্রিত হয়েছিল: 62.5 মিমি ট্রিস (হাইড্রোক্সিমিথাইল) অ্যামিনোমেথেন এইচসিএল (পিএইচ 6.8), 100 মিমি ডিটিটি, 2.5% এসডিএস, 10% গ্লিসারল এবং 0.005% ব্রোফেন নীলপ্রোটিনটি 90 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 5 মিনিটের জন্য গরম করে এবং 12% SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল।জেলটি Coomassie Brilliant Blue Solution (40% মিথানল, 10% অ্যাসিটিক অ্যাসিড, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) দিয়ে স্থির এবং দাগযুক্ত, রঙিন করা হয়েছে এবং 20 ঘন্টার জন্য একটি ফসফরেসেন্ট ইমেজিং স্ক্রিনে উন্মুক্ত করা হয়েছে (NMPy থেকে nsp12 সনাক্ত করতে) অথবা (সর্বোচ্চ) 2 ঘন্টা (nsp9 NMPylation মূল্যায়ন করতে)।স্ক্রিন স্ক্যান করতে একটি টাইফুন 9200 ইমেজার (জিই হেলথকেয়ার) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং ইমেজজে সিগন্যালের তীব্রতা বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।
MS বিশ্লেষণের জন্য, 1 µM nsp12-His6 এবং 10 µM nsp9 (হেক্সাহিস্টিডাইন ট্যাগ ছাড়া) NMPylation বিশ্লেষণে (SI পরিশিষ্ট, টেবিল S1) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং 500 µM UTP এবং GTP-এর বর্ধিত ঘনত্ব ব্যবহার করা হয়েছিল।তাদের ঘনত্ব এবং প্রত্যাশিত প্রোটিনের গুণমানের উপর নির্ভর করে, একটি MassPrep কলাম (জল) দিয়ে সজ্জিত একটি ওয়াটার অ্যাক্যুইটি এইচ-ক্লাস এইচপিএলসি সিস্টেম অনলাইনে 1 থেকে 10 μL বাফার প্রোটিন সলিউশন ডিসল্ট করতে ব্যবহার করা হয়েছিল।ডিসল্ট করা প্রোটিনটি বাফার A (জল/0.05% ফরমিক অ্যাসিড) এবং বাফার বি (অ্যাসিটোনিট্রিল/0.045% ফরমিক অ্যাসিড) এর নিম্নোক্ত গ্রেডিয়েন্টের মাধ্যমে Synapt G2Si ভর স্পেকট্রোমিটার (জল) এর ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়ন উৎসে প্রবেশ করা হয় এবং কলামের তাপমাত্রা হয় 60 ° C এবং 0.1 মিলি/মিনিটের প্রবাহের হার: 2 মিনিটের জন্য 5% A দিয়ে ইলিউশন, তারপর 8 মিনিটের মধ্যে 95% B রৈখিক গ্রেডিয়েন্ট, এবং আরও 4 মিনিটের জন্য 95% B বজায় রাখা।
500 থেকে 5000 m/z ভর পরিসীমা সহ ধনাত্মক আয়ন সনাক্ত করা হয়।Glu-fibrinopeptide B স্বয়ংক্রিয় ভর ড্রিফট সংশোধনের জন্য প্রতি 45 সেকেন্ডে পরিমাপ করা হয়।বেসলাইন এবং মসৃণ করার পরে গড় স্পেকট্রাম ডিকনভল করতে MaxEnt1 এক্সটেনশন সহ MassLynx ইন্সট্রুমেন্ট সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন।
UMPylated HCoV-229E nsp9 সিকোয়েন্সিং-গ্রেড পরিবর্তিত ট্রিপসিন (সার্ভা) যোগ করে হজম করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল।একটি ক্রোমাবন্ড C18WP স্পিন কলাম (অংশ নম্বর 730522; মাচেরি-নাগেল) পেপটাইডগুলিকে ডিসল্ট এবং ঘনীভূত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।অবশেষে, পেপটাইড 25 μL জলে দ্রবীভূত হয়েছিল, যার মধ্যে 5% অ্যাসিটোনিট্রিল এবং 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড ছিল।
অরবিট্র্যাপ ভেলোস প্রো মাস স্পেকট্রোমিটার (থার্মো সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে এমএস দ্বারা নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।চূড়ান্ত ন্যানো HPLC সিস্টেম (Dionex), একটি কাস্টম এন্ড-মাউন্ট করা 50 সেমি?75 μm C18 RP কলাম 2.4 μm চৌম্বক পুঁতি দিয়ে প্যাক করা (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon ন্যানোস্প্রে উৎসের মাধ্যমে অনলাইনে ভর স্পেকট্রোমিটারের সাথে সংযোগ করুন;একটি 300 μm ভিতরের ব্যাস ×??1 সেমি C18 পেপম্যাপ প্রাক-ঘনত্ব কলাম (থার্মো সায়েন্টিফিক)।দ্রাবক হিসাবে জল/0.05% ফরমিক অ্যাসিড ব্যবহার করে, নমুনাটি স্বয়ংক্রিয়ভাবে আটকা পড়ে এবং 6 μL/মিনিট প্রবাহের হারে বিশুদ্ধ হয়ে যায়।
জল/0.05% ফরমিক অ্যাসিড (দ্রাবক A) এবং 80% অ্যাসিটোনিট্রিল/0.045% ফরমিক অ্যাসিড (দ্রাবক B) এর নিম্নোক্ত গ্রেডিয়েন্টগুলি 300 nL/মিনিট প্রবাহ হারে ট্রিপটিক পেপটাইডের বিচ্ছেদ অর্জনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল: 4% B এর জন্য 5 মিনিট, তারপর 30 A রৈখিক গ্রেডিয়েন্ট মিনিটের মধ্যে 45% B, এবং 5 মিনিটের মধ্যে 95% দ্রাবক B এ রৈখিক বৃদ্ধি।ক্রোমাটোগ্রাফিক কলামটিকে একটি স্টেইনলেস স্টিলের ন্যানো-ইমিটার (প্রক্সিওন) এর সাথে সংযুক্ত করুন এবং 2,300 V এর সম্ভাব্যতা ব্যবহার করে ভর স্পেকট্রোমিটারের উত্তপ্ত কৈশিকটিতে সরাসরি ইলুয়েন্ট স্প্রে করুন। অরবিট্র্যাপ ভর বিশ্লেষকটিতে 60,000 এর রেজোলিউশন সহ জরিপ স্ক্যানটি যুক্ত। কমপক্ষে তিনটি ডেটা এমএস/এমএস স্ক্যান সহ, গতিশীলভাবে 30 সেকেন্ডের জন্য বাদ দেওয়া, রৈখিক আয়ন ফাঁদ সংঘর্ষ প্ররোচিত বিচ্ছিন্নতা বা উচ্চতর শক্তি সংঘর্ষ বিচ্ছিন্নকরণের সাথে মিলিত অরবিট্র্যাপ সনাক্তকরণ ব্যবহার করে, রেজোলিউশন হল 7,500।
পোস্টের সময়: আগস্ট-০৩-২০২১